利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選大豆結(jié)瘤因子受體NFR1α的互作蛋白

柯丹霞 彭昆鵬

利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選大豆結(jié)瘤因子受體NFR1α的互作蛋白

柯丹霞*彭昆鵬

信陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 / 大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院, 河南信陽(yáng) 464000

大豆是重要的植物蛋白作物和糧豆間作作物, 挖掘大豆的生物固氮潛力, 對(duì)推動(dòng)生態(tài)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。大豆結(jié)瘤因子受體蛋白GmNFR1a(Nod Factor Receptor)對(duì)結(jié)瘤至關(guān)重要, 但其具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究以大豆mRNA為模板, 利用RT-PCR方法擴(kuò)增到GmNFR1a蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域(GmNFR1a-pk), 構(gòu)建了pGBKT7-GmNFR1a-pk誘餌表達(dá)載體, 通過(guò)酵母雙雜交技術(shù), 篩選大豆根瘤AD-cDNA文庫(kù), 從文庫(kù)中分離到與GmNFR1a-pk相互作用的71個(gè)陽(yáng)性克隆, 經(jīng)測(cè)序和同源性分析篩選到12種與GmNFR1a-pk互作的蛋白, 包括鈣離子結(jié)合手性蛋白、豆血紅蛋白、結(jié)瘤素Nod44等蛋白。以大豆豆血紅蛋白GmLbc2為例, 回轉(zhuǎn)酵母以及煙草體內(nèi)BiFC驗(yàn)證其與誘餌蛋白的相互作用, 對(duì)其進(jìn)行同源蛋白比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析, 并利用百脈根毛根轉(zhuǎn)化技術(shù)鑒定GmLbc2在結(jié)瘤過(guò)程中的生物學(xué)功能。研究結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了GmNFR1a介導(dǎo)的結(jié)瘤信號(hào)傳遞途徑, 為大豆與根瘤菌共生互作機(jī)制提供了新的分子證據(jù)。

大豆; 共生固氮; 結(jié)瘤因子受體蛋白; 酵母雙雜交; 豆血紅蛋白

豆科植物與根瘤菌互惠共生, 在形成的特殊器官根瘤中, 大氣中分子態(tài)的氮被轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀恢参镏苯永玫陌?。?lèi)黃酮化合物作為豆科植物分泌的信號(hào)分子, 誘導(dǎo)根瘤菌產(chǎn)生結(jié)瘤因子(nod factor, NF)。NF作為根瘤菌信號(hào)分子反過(guò)來(lái)作用于豆科植物, 啟動(dòng)一系列結(jié)瘤反應(yīng)[1-3]。在模式豆科植物百脈根和苜蓿中, 結(jié)瘤因子受體蛋白分別為L(zhǎng)jNFR1和LjNFR5[4-5]、MtLYK3/MtLYK4和MtNFP[6-8]。它們屬于LysM類(lèi)受體激酶(LysM-RLKs), 由膜內(nèi)的絲/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、中部跨膜結(jié)構(gòu)域和膜外2~3個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域共同組成。百脈根LjNFR1和苜蓿MtLYK3均具有蛋白激酶活性, 而LjNFR5和MtNFP因?yàn)槿鄙偌せ瞽h(huán)而不具備激酶活性。研究表明, 百脈根的2個(gè)結(jié)瘤因子受體蛋白可以形成異源二聚體[9], 高親和性地直接結(jié)合NF[10-11], 并且LjNFR1能夠體外磷酸化LjNFR5[9], 這些證據(jù)表明結(jié)瘤因子受體蛋白可能以異源二聚體的形式與NF結(jié)合, 共同參與接收NF信號(hào), 隨后通過(guò)激酶間的磷酸化作用將NF信號(hào)傳遞下去。

近年的研究發(fā)現(xiàn), 結(jié)瘤因子受體蛋白接收并傳遞NF信號(hào)的過(guò)程還需要其他蛋白共同參與。在苜蓿中篩選到1個(gè)MtLYK3的互作蛋白-E3泛素連接酶MtPUB1。MtLYK3的激酶結(jié)構(gòu)域能夠磷酸化MtPUB1, MtPUB1在結(jié)瘤過(guò)程的早期侵染階段發(fā)揮作用[12]。在百脈根中也發(fā)現(xiàn)1個(gè)E3泛素連接酶LjPUB13能夠?qū)Ｒ坏胤核鼗疞jNFR5的激酶結(jié)構(gòu)域, 從而正調(diào)控百脈根根瘤器官的發(fā)生[13]。此外, 苜蓿中的MtSYMREM1能夠分別與MtLYK3和MtNFP互作, MtSYMREM1屬于Remorin蛋白, 是一類(lèi)植物特有的蛋白家族。MtSYMREM1在質(zhì)膜通過(guò)調(diào)控結(jié)瘤因子受體蛋白參與早期侵染過(guò)程, 影響侵染線(xiàn)的極性生長(zhǎng)以及根瘤菌的釋放[14]。同源克隆百脈根LjSYMREM1發(fā)現(xiàn), 它能夠在體內(nèi)與結(jié)瘤因子受體蛋白發(fā)生瞬時(shí)互作, 在體外能夠被LjNFR1磷酸化, 參與調(diào)控根瘤菌侵染過(guò)程[15]?？碌は嫉萚16-17]前期利用酵母雙雜交技術(shù), 在百脈根中篩選到LjNFR5的互作蛋白LjROP6, 并證實(shí)LjROP6正調(diào)控根瘤菌對(duì)豆科植物的侵染。最近張忠明研究團(tuán)隊(duì)又報(bào)道了1個(gè)新的LjNFR5相互作用蛋白-百脈根二氫黃酮醇還原酶LjDFL1, 并證實(shí)苜蓿中的同源蛋白MtNFP和MtDFL1之間也能夠發(fā)生相互作用, 推測(cè)這2種蛋白之間的互作在不同豆科植物中保守存在[18]。以上證據(jù)表明, NFRs及其介導(dǎo)的結(jié)瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在模式豆科植物百脈根和苜蓿中得到了較為廣泛和深入的研究, 而大豆中關(guān)于這方面的研究報(bào)道較少。

大豆()是一種重要的蛋白質(zhì)和油料作物。充分發(fā)揮大豆的根瘤共生固氮作用, 對(duì)提高產(chǎn)量, 改良品質(zhì)意義重大。大豆中已經(jīng)鑒定到4個(gè)結(jié)瘤因子受體蛋白, 即GmNFR1α/β和GmNFR5α/ β[19]。GmNFR1α和GmNFR1β分別位于大豆第2號(hào)、14號(hào)染色體上, 二者之間有著相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu), 堿基和氨基酸序列同源性分別為92%和89%。GmNFR1α和GmNFR1β在DNA序列和外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)上與LjNFR1高度相似, 與LjNFR1和MtLYK3的氨基酸序列相似性分別為79%和75%。生物學(xué)功能研究表明, 超表達(dá)GmNFR1α能夠增加每株大豆的結(jié)瘤數(shù), 而GmNFR1β的突變體對(duì)結(jié)瘤沒(méi)有影響, GmNFR1β在根瘤菌滴度較低情況下不能感知NF, 但是可以誘導(dǎo)皮層細(xì)胞分裂。GmNFR5α/β的突變體不能引起結(jié)瘤過(guò)程的任何形態(tài)學(xué)變化。GmNFR1β單獨(dú)與GmNFR5α/β結(jié)合, 在表皮和根毛細(xì)胞中不能有效識(shí)別NF, 根毛變形、卷曲以及侵染線(xiàn)的形成也被抑制。相反, GmNFR1α與GmNFR5α/β結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)完整的有效結(jié)瘤過(guò)程[19]。以上結(jié)果說(shuō)明, GmNFR1β的功能是冗余的, GmNFR1α與LjNFR1功能相似, 對(duì)結(jié)瘤至關(guān)重要。但是目前關(guān)于GmNFR1α 在共生互作中的具體功能和信號(hào)傳遞機(jī)制尚不清楚, 因此, 篩選GmNFR1α相互作用蛋白, 闡明互作蛋白之間結(jié)瘤信號(hào)的傳遞方式, 對(duì)于揭示GmNFR1α在結(jié)瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

本研究以大豆結(jié)瘤因子受體蛋白GmNFR1α為誘餌, 利用酵母雙雜交技術(shù), 篩選大豆根瘤AD-cDNA文庫(kù), 釣取GmNFR1α的互作蛋白, 通過(guò)互作蛋白的生物信息學(xué)分析及其在共生結(jié)瘤信號(hào)途徑中的生物學(xué)功能鑒定, 補(bǔ)充和完善GmNFR1α介導(dǎo)的結(jié)瘤信號(hào)傳遞途徑的認(rèn)知, 為大豆與根瘤菌共生互作機(jī)制提供新的分子證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆根瘤cDNA文庫(kù)、酵母菌株Y2Hgold、Y187由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所大豆研究室提供; 大豆品種Willimas 82由中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所孔凡江研究員提供; 酵母質(zhì)粒抽提試劑盒、ABA、X-α-Gal等購(gòu)自Clontech公司; pMD18-T載體、T4DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶、RNA提取及RT-PCR試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司; 常規(guī)的克隆載體、大腸桿菌菌株等均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 植物材料處理

在通風(fēng)廚中令大豆種子在生成的Cl2中消毒過(guò)夜[20]。將無(wú)菌種子種臍朝下均勻平鋪于無(wú)菌水潤(rùn)濕的濾紙上, 以封口膜密封培養(yǎng)皿, 22°C暗培養(yǎng)。大豆幼苗根長(zhǎng)2~3 cm時(shí)收集根部組織, 液氮速凍后保存于-80°C冰箱。

1.3 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的序列(GenBank登錄號(hào)為DQ219805)設(shè)計(jì)NFR1α-pk (943~ 1755位堿基)引物。F-NFR1α-pk為5′-GAGCTTGGAGAATAAAATTGG-3′ (下畫(huà)線(xiàn)部分為R I酶切位點(diǎn)), R-NFR1α-pk為5′-GCAAGTGTCATGAGAGCAAC-3′ (下畫(huà)線(xiàn)部分為I酶切位點(diǎn))。提取大豆根部組織總RNA, 按照TaKaRa公司RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 擴(kuò)增出片段, 其長(zhǎng)度為813 bp。將測(cè)序正確的目的片段經(jīng)RI/I雙酶切后連接到pGBKT7上。酶切、測(cè)序檢測(cè)無(wú)誤后即獲得誘餌質(zhì)粒pGBKT7- GmNFR1α-pk。

1.4 誘餌質(zhì)粒自激活及毒性檢測(cè)

采用LiAc法制備酵母菌株Y2HGold 的感受態(tài)細(xì)胞, 將測(cè)序正確的誘餌質(zhì)粒與pGADT7空載體共轉(zhuǎn)化Y2HGold, 以含有pGBKT7-53和pGADT7-T質(zhì)粒的酵母菌為陽(yáng)性對(duì)照, 以含有pGBKT7-lam和pGADT7-T 質(zhì)粒的酵母菌為陰性對(duì)照。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于DDO/X (SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal)平板, 置30°C培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)3~5 d, 觀(guān)察菌落的顯色情況, 確定誘餌蛋白是否具有自激活活性。分別挑取SD/–Trp平皿上直徑為2~3 mm的誘餌質(zhì)粒和對(duì)照空載體pGBKT7單菌落接種于SD/–Trp/Kan (50 μg mL-1)的液體培養(yǎng)基中, 30°C搖床培養(yǎng)24 h, 測(cè)定OD600值以判定誘餌蛋白是否對(duì)酵母菌株產(chǎn)生毒性。

1.5 篩選大豆根瘤AD-cDNA文庫(kù)

參照Clontech公司Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual所述方法, 接種新鮮的2~3 mm誘餌菌落到SD/–Trp液體培養(yǎng)基中, 30°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜至OD600達(dá)到0.8。離心, 棄上清液, 用4~5 mL SD/–Trp液體重懸沉淀。室溫融化1 mL文庫(kù)菌株, 將文庫(kù)菌株與誘餌菌株加入含有45 mL 2×YPDA/Kan (50 μg mL-1)液體培養(yǎng)基的2 L錐形瓶中, 30°C搖床低速振蕩培養(yǎng), 以防止細(xì)胞在錐形瓶中沉淀(劇烈搖動(dòng)會(huì)降低交配效率, 但晃動(dòng)過(guò)慢會(huì)使細(xì)胞沉淀, 也降低交配效率)。將雜交20~24 h后的混合液涂布在DDO/X/A (SD/–Leu/–Trp/X-a- Gal/AbA)選擇培養(yǎng)基上, 30°C培養(yǎng)4~6 d, 挑取直徑大于2 mm的藍(lán)色菌落點(diǎn)種于QDO/X/A (SD/–Ade/– His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA)選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~5 d, 觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)酵母的生長(zhǎng)及顯藍(lán)情況。

1.6 文庫(kù)陽(yáng)性克隆的鑒定

挑取QDO/X/A平板上生長(zhǎng)良好且顯藍(lán)的菌落, 參考Easy Yeast Plasmid Isolation Kit說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒。pGADT7載體通用引物(F-AD: 5′-CTATTCGA TGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′; R-AD: 5′- GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′)進(jìn)行菌落PCR, 根據(jù)擴(kuò)增的PCR片段大小分析pGADT7載體中插入的DNA片段長(zhǎng)度, 并排除大小一致的重復(fù)克隆, 初步確定陽(yáng)性克隆子。

1.7 陽(yáng)性克隆的測(cè)序及酵母回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

將上述陽(yáng)性克隆子轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 涂布于LB/Amp (100 μg mL-1)培養(yǎng)基上用于分離文庫(kù)質(zhì)粒。抽提文庫(kù)質(zhì)粒, 送交公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果將獲得的文庫(kù)質(zhì)粒逐一與pGBKT7-GmNFR1α-pk誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至Y2HGold酵母菌株中, 并在QDO/X/A選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選, 回轉(zhuǎn)酵母后再次顯藍(lán)的文庫(kù)質(zhì)粒可以保種用于今后的研究。

1.8 煙草體內(nèi)BiFC實(shí)驗(yàn)

根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的和序列分別構(gòu)建BiFC載體; 將測(cè)序正確的pSCYNE- NFR1α和pSCYCE(R)-GmLbc2熒光互補(bǔ)載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101, 倒置, 28°C培養(yǎng)2~3 d; 挑取單菌落于5 mL LBK液體培養(yǎng)基中, 28°C, 振蕩培養(yǎng)1~2 d, 待OD600達(dá)到0.6左右, 離心收集菌體, 用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化緩沖液分別將農(nóng)桿菌的OD600調(diào)至0.5, 等體積混合兩個(gè)熒光互補(bǔ)載體的農(nóng)桿菌懸浮液。室溫放置1 h活化農(nóng)桿菌; 去掉1 mL注射器的針頭, 吸取農(nóng)桿菌混合液, 注射至煙草葉片的下表皮; 將轉(zhuǎn)化后的煙草黑暗培養(yǎng)1~2 d; 然后制片, 用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察熒光信號(hào)并照相。

1.9 陽(yáng)性克隆的生物信息學(xué)分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析文庫(kù)載體中插入的DNA序列, 利用NCBI網(wǎng)站的Blast功能預(yù)測(cè)目的基因開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度以及編碼蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)特征, 用DNAMAN軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析, 利用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.10 轉(zhuǎn)GmLbc2基因超表達(dá)復(fù)合體植株的共生表型鑒定

將上述擴(kuò)增的基因全長(zhǎng)序列連入植物表達(dá)載體pU1301中, 構(gòu)建超表達(dá)載體pU 1301- GmLbc2, 并轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌LBA1334菌株中。利用百脈根()毛根轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因的超表達(dá)復(fù)合體植株。百脈根MG20種子經(jīng)表面滅菌、萌發(fā)后, 剪去下胚軸, 將幼苗子葉部分放入攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌懸液中侵染30 min, 隨后轉(zhuǎn)移到MS平板上暗培養(yǎng)5 d, 再移至含250 mg L-1羧卞的MS培養(yǎng)基上, 直至毛根長(zhǎng)出。取毛根根尖處1 cm根段, 用GUS染液鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性毛根, 然后提取陽(yáng)性毛根總RNA, 以RT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá), 百脈根多聚泛素(polyubiquitin)基因作為內(nèi)參, 空載體(pU1301)陽(yáng)性毛根作為陰性對(duì)照。將RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的復(fù)合體百脈根移入無(wú)菌沙盆中煉苗5 d, 接種根瘤菌MAFF303099, 每天澆灌無(wú)菌Fahraeus無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液。接種30 d后, 對(duì)結(jié)瘤表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并拍照, 根據(jù)單株結(jié)瘤數(shù)和樣本量(= 20), 計(jì)算單株(CK和GmLbc2-OX)平均結(jié)瘤數(shù), 試驗(yàn)重復(fù)3次, 采用Microsoft Excel 2007中的檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù), 并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建和自激活及毒性檢測(cè)

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的膜內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域, 大小為813 bp, 與預(yù)期長(zhǎng)度一致。通過(guò)R I/I雙酶切, 將構(gòu)建至誘餌載體pGBKT7上。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可獲得7300 bp的載體片段和813 bp 的插入片段(圖1-A)。測(cè)序結(jié)果表明, 插入片段與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的基因序列完全一致。說(shuō)明已成功克隆了基因并構(gòu)建了酵母誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GmNFR1α-pk。

共轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GmNFR1α-pk與pGADT7空載體, 以含有pGBKT7-53和pGADT7-T質(zhì)粒的酵母菌為陽(yáng)性對(duì)照, 以含有pGBKT7-lam和pGADT7-T質(zhì)粒的酵母菌為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示只有陽(yáng)性對(duì)照在DDO/X平板上出現(xiàn)藍(lán)色菌落, 誘餌質(zhì)粒和pGADT7空載體組合與陰性對(duì)照一樣, 只出現(xiàn)白色菌落(圖1-B~D), 說(shuō)明表達(dá)的GmNFR1α-pk誘餌蛋白不具有自激活活性。含有誘餌質(zhì)粒和對(duì)照空載體的2種酵母菌在相同條件下培養(yǎng)24 h后生長(zhǎng)情況相似, OD600值均大于0.8, 說(shuō)明誘餌蛋白長(zhǎng)勢(shì)良好, 對(duì)酵母菌株無(wú)毒性, 可以直接用于后續(xù)酵母雙雜交文庫(kù)的篩選。

圖1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GmNFR1α-pk的構(gòu)建及自激活檢測(cè)

(A) M: trans 2K Plus II DNA marker; 1: GmNFR1α-pk目的片段擴(kuò)增; 2: pGBKT7-GmNFR1α-pk誘餌質(zhì)粒雙酶切; 3: pGBKT7空載體雙酶切。(B)陽(yáng)性對(duì)照(pGBKT7-53和pGADT7-T)。(C)陰性對(duì)照(pGBKT7-lam和pGADT7-T)。(D) pGBKT7-GmNFR1α-pk與pGADT7空載體。

(A) M: trans 2K Plus II DNA marker; 1: isolation of GmNFR1α-pk cDNA; 2: pGBKT7-GmNFR1α-pk digested byRI andI; 3: pGBKT7 digested byRI andI. (B) positive control (pGBKT7-53 and pGADT7-T). (C) negative control (pGBKT7-lam and pGADT7-T). (D) pGBKT7-GmNFR1α-pk and pGADT7.

2.2 篩選與GmNFR1α-pk互作的蛋白

以pGBKT7-GmNFR1α-pk為誘餌篩選大豆根瘤cDNA文庫(kù), 將含有誘餌質(zhì)粒的酵母菌株Y2HGold與含有文庫(kù)的酵母菌株Y187進(jìn)行有性雜交, 將雜交后的混合液涂布于DDO/X/A平板上, 30°C培養(yǎng)4~6 d, 挑取直徑大于2 mm的藍(lán)色菌落點(diǎn)種于QDO/X/A平板上培養(yǎng)3~5 d, 統(tǒng)計(jì)菌落生長(zhǎng)及顯藍(lán)情況。結(jié)果共有71個(gè)生長(zhǎng)狀況良好且顯藍(lán)的菌落, 部分結(jié)果見(jiàn)圖2-A。

挑取QDO/X/A平板上的陽(yáng)性菌落, 擴(kuò)繁并提取酵母質(zhì)粒, 以PCR鑒定cDNA文庫(kù)插入片段的大小, 舍棄500 bp 以下的小片段(圖2-B)。將剩余的陽(yáng)性酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5, 菌液送交公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定, 測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較, 將載體的閱讀框與目的基因不同的克隆排除掉, 最終篩選到12種與GmNFR1α-pk互作的蛋白, 包括鈣離子結(jié)合手性蛋白、豆血紅蛋白、結(jié)瘤素Nod44、肌醇-磷酸合酶、甲酰轉(zhuǎn)移酶、氨基酸轉(zhuǎn)移酶、NAD激酶、分子伴侶樣蛋白HYPK、抗增殖蛋白prohibitin-2等。

圖2 酵母雙雜交 cDNA 文庫(kù)的篩選

(A) QDO/X/A平板上的陽(yáng)性克隆; (B) PCR 檢測(cè)酵母雙雜交cDNA文庫(kù)插入片段大小。

(A) positive clones on QDO/X/A plate; (B) PCR detection of inserts from yeast two-hybrid cDNA library.

2.3 蛋白相互作用的驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證GmNFR1α-pk與靶蛋白的相互作用, 本研究以篩選到的其中一個(gè)互作蛋白-大豆血紅蛋白GmLbc2 (Leghemoglobin C2)為例, 分別將GmLbc2/GmNFR1α-pk、陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2HGold, 涂在QDO/X/A培養(yǎng)基上, 30°C培養(yǎng)3~5 d。觀(guān)察發(fā)現(xiàn), GmNFR1α-pk與靶蛋白GmLbc2共轉(zhuǎn)化時(shí), 在QDO/X/A培養(yǎng)基上菌落呈藍(lán)色(圖3-A), 表明二者在酵母體內(nèi)能夠發(fā)生相互作用,酵母回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了陽(yáng)性克隆的正確性, 排除了假陽(yáng)性的干擾。將和基因分別構(gòu)建到BiFC中配對(duì)的2個(gè)載體上, 然后通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)共轉(zhuǎn)化煙草, 在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察熒光發(fā)生情況, 證實(shí)2個(gè)蛋白在煙草體內(nèi)也存在相互作用, 且互作的位置在煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜(圖3-B)。

2.4 GmLbc2蛋白的生物信息學(xué)分析

已有研究表明, 大豆血紅蛋白GmLb受根瘤菌誘導(dǎo)表達(dá), 是存在于共生根瘤類(lèi)菌體內(nèi)的一種組織特異性蛋白。GmLb的含量和根瘤的固氮酶活性呈正相關(guān)性, 根瘤中GmLb未表達(dá)前, 根瘤是沒(méi)有固氮能力的; 隨著GmLb含量的增加, 固氮能力增強(qiáng); 衰老的根瘤伴隨著GmLb的消失, 固氮作用也喪失。GmLb由4個(gè)主要組分Lbc1、Lbc2、Lbc3、Lba構(gòu)成。本研究中篩選到的GmNFR1α-pk互作蛋白即為其中的Lbc2蛋白。序列分析表明, 全長(zhǎng)的大豆基因大小為438 bp, 編碼蛋白包含145個(gè)氨基酸殘基。預(yù)測(cè)的分子量大小為15.5 kD, 理論等電點(diǎn)為5.38。經(jīng)過(guò)Blastp以及DNAMAN軟件分析, 對(duì)大豆基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)發(fā)現(xiàn), GmLbc2與GmLbc3、野生大豆GsLbc1和GmLba同源性較高(圖4)。同時(shí), GmLbc2蛋白與上述不同豆科植物的豆血紅蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析表明, GmLbc2與GmLbc3處在同一進(jìn)化分支上, 親緣關(guān)系最近(圖5)。

2.5 過(guò)表達(dá)GmLbc2基因?qū)Π倜}根陽(yáng)性毛根共生結(jié)瘤的影響

為了鑒定基因在結(jié)瘤過(guò)程中的生物學(xué)功能, 根據(jù)基因序列信息, 構(gòu)建超表達(dá)載體pU1301-通過(guò)毛根轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入模式豆科植物百脈根毛根中, 進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)。接種根瘤菌30 d后,基因在百脈根毛根中的過(guò)量表達(dá)可以顯著增加結(jié)瘤數(shù)目(圖6-A~C)。qRT-PCR結(jié)果顯示, 在超表達(dá)植株中基因的表達(dá)水平為對(duì)照的12倍, 說(shuō)明百脈根復(fù)合體植株結(jié)瘤數(shù)目的增加是由于GmLbc2基因的過(guò)量表達(dá)引起的。以qRT-PCR進(jìn)一步分析結(jié)瘤標(biāo)志基因NIN、ENOD40-1和ENOD40-2在復(fù)合體植株毛根中的表達(dá)水平表明, GmLbc2基因的過(guò)量表達(dá)顯著增加這3種結(jié)瘤標(biāo)志基因的表達(dá)水平(圖6-D)。

圖3 GmNFR1α與GmLbc2相互作用的驗(yàn)證

(A)酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證GmNFR1α-pk與GmLbc2的相互作用。1: 陽(yáng)性對(duì)照(pGBKT7-53和pGADT7-T); 2: 陰性對(duì)照(pGBKT7-lam和pGADT7-T); 3: pGBKT7-GmNFR1α-pk與pGADT7-GmLbc2。(B)雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)驗(yàn)證GmNFR1α全長(zhǎng)與GmLbc2的相互作用。

(A) yeast two-hybrid analysis of interaction between GmNFR1α-pk and GmLbc2. 1: positive control (pGBKT7-53 and pGADT7-T); 2: negative control (pGBKT7-lam and pGADT7-T); 3: pGBKT7-GmNFR1α-pk and pGADT7-GmLbc2. (B) BiFC analysis of interaction between GmNFR1α and GmLbc2.

3 討論

大豆在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著舉足輕重的作用, 大豆與谷物作物玉米、小麥等間作可促進(jìn)氮的轉(zhuǎn)移, 減少施肥量的同時(shí)增加谷物作物的產(chǎn)量, 并改善土壤氮營(yíng)養(yǎng)狀況, 對(duì)大豆共生信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。前人研究表明, 過(guò)量表達(dá)大豆結(jié)瘤因子受體激酶GmNFR1α可以使結(jié)瘤增加, 并增強(qiáng)大豆植株在酸性土壤中形成根瘤的能力。GmNFR1α能夠直接參與調(diào)控大豆G蛋白信號(hào)通路。G蛋白亞基Gα與G蛋白活性調(diào)節(jié)因子RGS都能夠直接與GmNFR1α發(fā)生相互作用, GmNFR1α通過(guò)磷酸化RGS, 調(diào)控Gα蛋白活性, 從而維持根瘤的正常發(fā)育[21-22]。目前關(guān)于GmNFR1α在共生結(jié)瘤固氮中的信號(hào)傳遞機(jī)制研究才剛剛起步, 其介導(dǎo)的下游信號(hào)傳遞途徑仍有待進(jìn)一步補(bǔ)充和完善。因此, 篩選新的GmNFR1α相互作用蛋白, 闡明互作蛋白之間結(jié)瘤信號(hào)的傳遞方式, 對(duì)于揭示GmNFR1α在結(jié)瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的調(diào)控機(jī)制具有重要意義, 該工作具有原創(chuàng)性。酵母雙雜交技術(shù)可以在活體內(nèi)驗(yàn)證蛋白之間的相互作用, 是一種高效發(fā)掘新基因、探索基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的方法[23]。本研究成功地利用該系統(tǒng)篩選到GmNFR1α的相互作用蛋白, 并對(duì)這些靶蛋白進(jìn)行了進(jìn)化及功能分析, 為揭示GmNFR1α在結(jié)瘤因子信號(hào)傳遞過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供了新證據(jù)。

利用BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的靶蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能域和同源性分析, 篩選到12種與GmNFR1α-pk互作的蛋白, 包括鈣離子結(jié)合手性蛋白、豆血紅蛋白、結(jié)瘤素Nod44、肌醇-磷酸合酶、甲酰轉(zhuǎn)移酶、氨基酸轉(zhuǎn)移酶、NAD 激酶、分子伴侶樣蛋白HYPK、抗增殖蛋白prohibitin-2等。其中, 重復(fù)克隆數(shù)最多的蛋白為大豆血紅蛋白GmLbc2。大豆血紅蛋白與固氮作用密切相關(guān), 通過(guò)調(diào)節(jié)根瘤中游離O2的濃度, 保護(hù)類(lèi)菌體產(chǎn)生的易受O2破壞的固氮酶[24]。根瘤中大豆血紅蛋白的含量與固氮酶活性呈正相關(guān)性, 根瘤菌侵染大豆根系誘導(dǎo)大豆血紅蛋白表達(dá)后, 根瘤才能夠正常地進(jìn)行固氮作用, 才能為宿主植物提供生長(zhǎng)所需的氮源[25]。在大豆結(jié)瘤信號(hào)途徑中，本研究首次將結(jié)瘤因子受體蛋白與豆血紅蛋白聯(lián)系起來(lái), 證實(shí)二者在酵母體內(nèi)的互作。推測(cè)GmNFR1α-pk與GmLbc2互作可能將早期結(jié)瘤因子信號(hào)感知和后期有效根瘤的形成有機(jī)整合起來(lái), 但具體作用方式及機(jī)制還需進(jìn)一步研究。下一步我們將通過(guò)細(xì)胞生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究這些靶蛋白與GmNFR1α的互作機(jī)制和互作功能區(qū)域, 通過(guò)靶標(biāo)基因的超表達(dá)和敲除實(shí)驗(yàn)研究這些靶蛋白的生物學(xué)功能, 期待破解大豆結(jié)瘤因子受體蛋白GmNFR1α在共生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的具體功能及分子調(diào)控機(jī)制。

圖4 大豆GmLbc2與其他植物同源蛋白的序列比對(duì)分析

Gm: 栽培大豆,; Gs: 野生大豆,; Cc: 木豆,; Va: 赤豆,; Vr: 綠豆,; Mt: 蒺藜苜蓿,; Lj: 百脈根,; As: 紫云英,。

Gm:; Gs:; Cc:; Va:; Vr:; Mt:; Lj:; As:.

圖5 大豆GmLbc2蛋白與同系物的系統(tǒng)進(jìn)化分析

標(biāo)尺代表遺傳相似性, 表明不同物種間同系物進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近。縮寫(xiě)同圖4。

The scale represents genetic similarity, indicating the proximity relationships among species. Abbreviations are the same as those given in Fig. 4.

綜上所述, 本研究從大豆根瘤AD-cDNA文庫(kù)中獲得多個(gè)與GmNFR1α相互作用的靶蛋白, 并以大豆血紅蛋白GmLbc2為例, 對(duì)其進(jìn)行同源蛋白比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析, 推測(cè)二者互作共同調(diào)控結(jié)瘤過(guò)程, 研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明GmNFR1α的信號(hào)傳遞機(jī)制提供了理論依據(jù)?？梢韵嘈? 對(duì)GmNFR1α互作蛋白功能及作用機(jī)制的深入研究必將大大推動(dòng)大豆共生信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究, 也將為實(shí)現(xiàn)非豆科植物的共生固氮提供重要的科學(xué)線(xiàn)索。

4 結(jié)論

利用酵母雙雜交篩選大豆根瘤中GmNFR1α- pk的相互作用蛋白, 獲得12種靶蛋白。以大豆豆血紅蛋白GmLbc2為例, 對(duì)其進(jìn)行同源蛋白比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及生物學(xué)功能分析, 為進(jìn)一步闡明GmNFR1α的信號(hào)傳遞機(jī)制提供了理論依據(jù)。

圖6 過(guò)表達(dá)GmLbc2對(duì)百脈根陽(yáng)性毛根共生結(jié)瘤的影響

(A)空載體對(duì)照復(fù)合體植株的結(jié)瘤表型。(B)超表達(dá)(GmLbc2-OX)復(fù)合體植株的結(jié)瘤表型; 接種根瘤菌30 d 后照相, Bars = 5 mm。(C)平均每個(gè)植株的結(jié)瘤數(shù)目, **表示<0.01。(D) qRT-PCR檢測(cè)、、和的表達(dá)水平。

(A) phenotype of hairy roots expressing p1301U (CK). (B) phenotype of hairy roots overexpressing(GmLbc2-OX); photographs were taken at 30 d after inoculation, Bars = 5 mm. (C) mean number of nodules per plant with standard deviation (SD) ofexpressing empty vector pU1301 (CK) of GmLbc2-OX at 30 days after inoculation with, **<0.01. (D) transcript levels of,,, andin CK and GmLbc2-OX hairy roots detected by qRT-PCR.

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Screening of NFR1α-interactive proteins in soybean using yeast two hybrid system

KE Dan-Xia*and PENG Kun-Peng

College of Life Sciences, Xinyang Normal University / Institute for Conservation and Utilization of Agro-bioresources in Dabie Mountains, Xinyang 464000, Henan, China

Soybean is the important plant protein crop and grain-bean intercropping crop. Exploring the biological nitrogen fixation potential of soybean is of far-reaching significance to promote the sustainable development of ecological agriculture. GmNFR1α, a soybean nod factor receptor protein, is very important for nodulation, but its specific regulatory mechanism is still unclear. Soybean mRNA was used as template to amplify the kinase domain of GmNFR1α protein (GmNFR1α-pk) by RT-PCR method and the pGBKT7-GmNFR1α-pk bait plasmid was constructed. Seventy-two positive clones interacted with GmNFR1α-pk were isolated through yeast two hybrid screening of soybean nodule AD-cDNA library from the library. Among them, 12 proteins including calcium ion binding chiral protein, hemoglobin, nodulin Nod44 and other proteins interacted with GmNFR1α-pk were screened by sequencing and homology analysis. The interaction between soybean hemoglobin and bait protein was verified by re-transforming in yeast and BiFC in tobacco. Comparison of homologous proteins and phylogenetic tree analysis were also done at the same time. The important function of GmLbc2 in nodulation process was clarified by hairy root transformation technology in. The results further complement and improve the signal transduction pathway mediated by GmNFR1α, and provide new molecular evidence for the symbiotic interaction mechanism between soybean and rhizobia.

soybean; symbiotic nitrogen fixation; nod factor receptor protein; yeast two-hybrid; soybean hemoglobin

2019-03-07;

2019-08-09;

2019-09-02.

10.3724/SP.J.1006.2020.94036

柯丹霞, E-mail: kdx_029@163.com

研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400213), 河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(182102110448)和信陽(yáng)師范學(xué)院“南湖學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃”青年項(xiàng)目(2016)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31400213), the Science and Technology Research Projects of Henan Province (182102110448), and the Nanhu Scholars Program for Young Scholars of XYNU (2016).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190902.1502.004.html