羥基喜樹堿脂質(zhì)體的制備及其抗腫瘤效果的評價

陳文忠，莊翌，郝翌，陳家英，騰德義，段曉波，梅勝堯，杜穎,陳寶安

(1.南京綠葉制藥有限公司，江蘇 南京 210061；2.江蘇省藥物研究所，江蘇 南京 210009；3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 血液科，江蘇 南京 210009)

羥基喜樹堿是20世紀(jì)60年代從喜樹堿中分離得到的一種吲哚生物堿，對人類惡性腫瘤具有廣泛的抗腫瘤活性，其機制與選擇性抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ有關(guān)，可干擾DNA復(fù)制。由于羥基喜樹堿溶解度低、內(nèi)酯環(huán)不穩(wěn)定以及腫瘤中多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低了它的生物利用度，極大地限制了其在靶點的濃度和療效[1- 3]。喜樹堿羥基化衍生物屬有效的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑[4]，具有更好的抗腫瘤作用、更低的毒性和更寬的抗瘤譜，其活性基團是其母體結(jié)構(gòu)E環(huán)上的δ內(nèi)酯環(huán)，它通過作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ干擾癌細(xì)胞DNA的復(fù)制，從而使癌細(xì)胞凋亡。但由于羥基喜樹堿不溶于水的性質(zhì)，以及其重要活性基團δ內(nèi)酯環(huán)在血循環(huán)中(血液pH約7.4)水解成羧酸型而活性降低[5- 8]，影響臨床使用的順應(yīng)性及療效。為進(jìn)一步開拓羥基喜樹堿的抗腫瘤作用，我們從羥基喜樹堿的遞藥系統(tǒng)方面著手研究，將羥基喜樹堿制成脂質(zhì)體，利用小鼠肝癌H22和小鼠肉瘤S180兩種實體瘤動物模型，觀察了羥基喜樹堿脂質(zhì)體的抑瘤作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

羥基喜樹堿原料藥購自美爾雅(集團)美升藥業(yè)有限公司，蛋黃卵磷脂購自南京綠葉制藥有限公司，膽固醇購自南京新百藥業(yè)有限公司；甲醇、乙腈為色譜純試劑，其他試劑為分析純；環(huán)磷酰胺批號03112721，購自江蘇省恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 動物

昆明種小鼠，體重18～22 g，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號SCXK(蘇) 2002—0031。小鼠H22肝癌腹水型和小鼠S180肉瘤腹水型種鼠購自江蘇省腫瘤防治研究所。

1.3 羥基喜樹堿脂質(zhì)體的制備

將卵黃卵磷脂、膽固醇、羥基喜樹堿溶于適量無水乙醇中，過0.22 μm濾膜除菌，濾液置茄形瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓抽干成膜。

將枸櫞酸鈉、枸櫞酸溶于適量5%葡萄糖注射液，使最終溶液pH為5.0，過0.22 μm濾膜除菌，再將此溶液加入到上述茄形瓶中洗膜，洗膜完全后置于熱水浴中孵育20 min，再冷卻，進(jìn)行高壓均質(zhì)處理，并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌。按每瓶含2 mg羥基喜樹堿進(jìn)行分裝、凍干、壓塞、出箱、軋口，即獲得羥基喜樹堿脂質(zhì)體。

1.4 羥基喜樹堿脂質(zhì)體理化性質(zhì)表征

1.4.1 粒徑的測定 取羥基喜樹堿脂質(zhì)體適量，以注射用水稀釋，用Zetasizer 3000HS 激光粒度分析儀測定其粒徑。

1.4.2 包封率及δ內(nèi)酯環(huán)占比的測定 填充Sephadex凝膠柱，并以洗脫介質(zhì)平衡。取羥基喜樹堿脂質(zhì)體適量，置于填充好的柱體上部，以水為洗脫介質(zhì)，調(diào)整流速為1 ml·min-1，分別收集脂質(zhì)體部分和游離藥部分，并分別測定其含量，計算包封率。測定脂質(zhì)體中羥基喜樹堿的δ內(nèi)酯環(huán)形式含量及羥基喜樹堿含量，計算δ內(nèi)酯環(huán)所占比例。

1.4.3 脂質(zhì)體形態(tài)觀察 取制備所得脂質(zhì)體適量，稀釋至5～10 μg·ml-1后滴于銅網(wǎng)上，并以1.0%磷鎢酸復(fù)染，透射電鏡觀察其形態(tài)并拍照。

1.5 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對小鼠肉瘤S180 和小鼠肝癌H22實體瘤的影響

1.5.1 荷瘤小鼠模型的建立 分別取H22肝癌腹水型

和小鼠S180肉瘤腹水型種鼠，在無菌條件下抽取腹水，以無菌生理鹽水按1∶3稀釋，計數(shù)并調(diào)整濃度，每只小鼠右前肢腋下皮下接種瘤液0.2 ml。

1.5.2 動物分組與給藥 在接種后第2天將動物隨機分組并開始給藥, H22肝癌和S180肉瘤小鼠各分為8組，即空白對照組、環(huán)磷酰胺陽性藥(30 mg·kg-1)對照組、市售羥基喜樹堿注射液3個給藥濃度(14、7、3 mg·kg-1)組、羥基喜樹堿脂質(zhì)體3個給藥濃度(3、2、1 mg·kg-1)組，每組10只。各給藥組每隔1天靜脈注射給藥1次，共給藥3次，空白對照組每隔1天靜脈注射生理鹽水1次，各組動物靜脈注射體積均為0.2 ml·kg-1。實驗期間每日稱量體重，本實驗重復(fù)3批。

1.5.3 血液采集與處理 在末次給藥后第5天采集各組動物血液，涂片并進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)。

1.5.4 測定抑瘤率 在末次給藥后第5天處死動物，剝離腋下瘤塊并稱重，計算抑瘤率。

1.5.5 病理學(xué)檢測 在H22肝癌小鼠末次給藥后第5天處死動物，取出股骨, 剔除肌肉等組織，剪去股骨兩端，將骨髓滴在潔凈玻片上，用小牛血清將骨髓混勻，均勻推片，制成骨髓片，常規(guī)染色并計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 羥基喜樹堿脂質(zhì)體粒徑

經(jīng)馬爾文粒徑儀測定，所制備的羥基喜樹堿脂質(zhì)體平均粒徑為357 nm。

2.2 包封率及δ內(nèi)酯環(huán)形式占比

羥基喜樹堿脂質(zhì)體的包封率為94.4%，滿足藥典對脂質(zhì)體藥物包封率的要求；其δ內(nèi)酯環(huán)形式占總含量的98%以上，表明羥基喜樹堿脂質(zhì)體制劑中δ內(nèi)酯環(huán)未發(fā)生降解，活性基團得到了良好的保護(hù)，有助于藥效的發(fā)揮。

2.3 羥基喜樹堿脂質(zhì)體形態(tài)

透射電鏡照下羥基喜樹堿脂質(zhì)體呈現(xiàn)規(guī)整、均一的球形結(jié)構(gòu)(圖1)，且尺寸為320 nm，與粒徑測定結(jié)果一致。

圖1 透射電鏡下羥基喜樹堿的形態(tài) ×16.2萬

2.4 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對小鼠肝癌H22和肉瘤S180實體瘤的抗腫瘤作用

不同劑量的羥基喜樹堿脂質(zhì)體對H22肝癌顯示不同程度的抑制作用，3個劑量組呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系, 與空白對照組比較，羥基喜樹堿脂質(zhì)體抑瘤率為79%～90%(P<0.001)，環(huán)磷酰胺抑瘤率平均為85.8%(P<0.001)； 3 mg·kg-1羥基喜樹堿脂質(zhì)體抑瘤率平均為89.5%,3 mg·kg-1市售羥基喜樹堿抑瘤率平均為27.5%,二者抑瘤率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 羥基喜樹堿對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

不同劑量的羥基喜樹堿脂質(zhì)體對小鼠S180肉瘤顯示不同程度的抑制作用，3個劑量組呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系, 與空白對照組比較，羥基喜樹堿脂質(zhì)體抑瘤率為51%～68%(P<0.001)，環(huán)磷酰胺抑瘤率平均為73.6%(P<0.001)； 3 mg·kg-1羥基喜樹堿脂質(zhì)體抑瘤率平均為67.2%,3 mg·kg-1市售羥基喜樹堿抑瘤率平均為20.7%,二者抑瘤率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表2。

表2 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對S180荷瘤小鼠瘤體生長的影響

2.5 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對小鼠外周血白細(xì)胞及骨髓的影響

除市售羥基喜樹堿3 mg·kg-1和羥基喜樹堿脂質(zhì)體1 mg·kg-1組白細(xì)胞總數(shù)未見明顯下降，其余劑量組白細(xì)胞總數(shù)有所下降，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；羥基喜樹堿脂質(zhì)體及市售羥基喜樹堿注射液給藥組白細(xì)胞數(shù)量隨著劑量的增加而減少，均呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。見表3、4。

表3 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對H22荷瘤小鼠白細(xì)胞總數(shù)的影響

表4 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對S180荷瘤小鼠白細(xì)胞總數(shù)的影響

羥基喜樹堿脂質(zhì)體各劑量給藥組未見對骨髓細(xì)胞有抑制作用，與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。市售羥基喜樹堿注射液14 mg·kg-1組中幼紅細(xì)胞數(shù)量與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，7、3 mg·kg-1組未發(fā)生明顯變化，推測該變化可能與市售羥基喜樹堿注射液高劑量用藥相關(guān)；環(huán)磷酰胺給藥組多種骨髓細(xì)胞(晚幼紅細(xì)胞、原始粒細(xì)胞、中性中幼粒細(xì)胞、中性晚幼粒細(xì)胞、中性桿狀粒細(xì)胞)數(shù)量發(fā)生明顯變化，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，表明30 mg·kg-1環(huán)磷酰胺對小鼠骨髓細(xì)胞具有損傷作用。見表5。

表5 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對骨髓細(xì)胞分類的影響

3 討 論

國內(nèi)外已有采取脂質(zhì)體等制劑手段改善喜樹堿類藥物穩(wěn)定性的研究。2000年Tracli等[9]報道了拓?fù)涮婵抵|(zhì)體的研究情況，在小鼠靜脈給藥后測定小鼠血液中閉環(huán)拓?fù)涮婵档暮?，與拓?fù)涮婵邓槃┻M(jìn)行比較。他們的研究結(jié)果表明：在拓?fù)涮婵邓樈o藥5 min后，血液中的拓?fù)涮婵抵挥?0%為閉環(huán)形式；而拓?fù)涮婵抵|(zhì)體給藥4 h后，血液中的拓?fù)涮婵等杂?5%為閉環(huán)形式。該研究證明了將拓?fù)涮婵蛋谥|(zhì)體中能很好地達(dá)到保護(hù)δ內(nèi)酯環(huán)的目的。Thomas G Burke等[10]報道喜樹堿類新衍生物L(fēng)urtotecan以脂質(zhì)體為載體，在動物試驗中可以顯著增加抗腫瘤效果，認(rèn)為脂質(zhì)體可以穩(wěn)定喜樹堿類的內(nèi)酯環(huán)，比如在PBS緩沖液中3 h Lurtotecan脂質(zhì)體內(nèi)酯環(huán)>90%，而普通Lurtotecan僅有15%，在人體血液中3 h Lurtotecan脂質(zhì)體內(nèi)酯環(huán)仍有80%。

在本研究中，我們采用薄膜分散法制備了羥基喜樹堿脂質(zhì)體，其粒徑為357 nm，包封率為94.4%，方法簡單易行，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

我們進(jìn)一步對羥基喜樹堿的體內(nèi)藥效和安全性進(jìn)行了評價，結(jié)果表明，羥基喜樹堿脂質(zhì)體對小鼠肝癌H22和小鼠肉瘤S180腫瘤生長有較強的抑制作用，相同劑量下，羥基喜樹堿脂質(zhì)體抑瘤效果為市售羥基喜樹堿注射液的3～4倍。羥基喜樹堿脂質(zhì)體顯著的抑瘤效果可能與羥基喜樹堿的脂質(zhì)體劑型相關(guān)，將羥基喜樹堿制備成脂質(zhì)體后改善了羥基喜樹堿的水溶性，優(yōu)化了體內(nèi)的藥動學(xué)行為，使其在體內(nèi)的半衰期延長，穩(wěn)定了羥基喜樹堿在體內(nèi)的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，同時羥基喜樹堿脂質(zhì)體也更容易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，從而提高了抗腫瘤藥效。在H22肝癌小鼠和S180肉瘤小鼠的各給藥組(除小劑量組)白細(xì)胞總數(shù)有所下降，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而羥基喜樹堿脂質(zhì)體與市售羥基喜樹堿注射液各給藥組相比，白細(xì)胞總數(shù)無明顯差異，但兩者給藥后體內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)均隨著給藥劑量的增加而減少，表明血液中白細(xì)胞總數(shù)的減少與供試品和對照品相關(guān)，呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性；在H22肝癌小鼠中，各劑量給藥組均未見對骨髓細(xì)胞有抑制作用。本實驗結(jié)果顯示，羥基喜樹堿脂質(zhì)體具有比羥基喜樹堿注射液更好的抑瘤效果，同時未增加羥基喜樹堿注射液毒性。

傳統(tǒng)的治療惡性腫瘤方式以靜脈注射化療藥物為主，但是這種方式的藥物選擇性相對較差，且毒副作用較大。因此基于藥物傳遞系統(tǒng)進(jìn)而將藥物有效地遞送至腫瘤部位，對減輕毒副作用和增強抗腫瘤效果有很大的幫助[11]。長期以來，南京綠葉制藥有限公司在研制脂質(zhì)體新劑型和符合我國國情的脂質(zhì)體膜材料即高純度蛋黃卵磷脂方面積累了較為豐富的經(jīng)驗。國外喜樹堿類脂質(zhì)體的研究，大多采用合成磷脂(DPPC、Sphingomyelin、DLPC、DSPC)為膜材料，結(jié)合國情，我們采用了資源豐富的雞蛋黃卵磷脂替代DSPC等合成磷脂，解決了由于羥基喜樹堿為水不溶、脂難溶性藥物，難以達(dá)到較高的包封率的難題。我們研制的羥基喜樹堿脂質(zhì)體包封率達(dá)到93%以上，平均粒徑在350 nm左右，藥效學(xué)研究結(jié)果達(dá)到預(yù)期研究目的，羥基喜樹堿脂質(zhì)組合物及其制備方法已申請并獲得國家發(fā)明專利授權(quán)(專利號：ZL200310112772.6)。

綜上所述，羥基喜樹堿脂質(zhì)體的研發(fā)成功，將使我國特有的重要廣譜抗癌藥羥基喜樹堿資源進(jìn)一步得到深入的開發(fā)，為我國乃至全世界廣大腫瘤患者帶來福音，使他們獲得新生或者延長生命，改善生活質(zhì)量。