煙曲霉在果樹生產(chǎn)上的安全應(yīng)用探討

摘 要：通過煙曲霉利用農(nóng)作物秸稈對(duì)果樹生產(chǎn)安全應(yīng)用的可行性進(jìn)行闡述，在增加土壤肥力、防治果樹病蟲害、治理果園環(huán)境污染3個(gè)方面具有的潛在應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了分析。

關(guān)鍵詞：煙曲霉;果樹;安全應(yīng)用;秸稈

文章編號(hào)：2096-8108（2020）03-0065-04?中圖分類號(hào)：S66?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：The feasibility of using crop straw by Aspergillus fumigatus in the production and safety of fruit trees was discussed. It is potentially used for increasing soil fertility， controlling crop diseases and decreasing agricultural environmental pollution.

Keywords：Aspergillus fumigates; Fruit tree; Safe application; Crop straw

長(zhǎng)期以來，化肥、農(nóng)藥和薄膜是果農(nóng)實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)增收的重要手段，病蟲害是影響果樹生產(chǎn)的一個(gè)重要問題。目前，過度施肥、殘留高劑量農(nóng)藥、白色污染或是秸稈焚燒都會(huì)影響地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品銷售的信譽(yù)和口碑。因此，防治果樹病蟲害、治理果樹環(huán)境污染和提高農(nóng)作物秸稈利用率意義重大。煙曲霉（Aspergillus fumigatus）是在世界范圍內(nèi)廣泛存在的一類真菌，耐鹽，耐高溫（30～40 ℃），遺傳性狀穩(wěn)定。早在20世紀(jì)40年代，已經(jīng)有報(bào)道列出從煙曲霉代謝中分離到的一種物質(zhì)煙曲霉酸（Fumigacin）可以作為殺菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1]，這種殺菌劑來源天然，研究認(rèn)為能阻斷病原真菌蛋白質(zhì)合成[2]。多年來，煙曲霉的應(yīng)用一直有文獻(xiàn)報(bào)道，已證明對(duì)果樹生產(chǎn)環(huán)境中的有機(jī)質(zhì)[3]、殘留農(nóng)藥污染[4-6]、廢棄農(nóng)用薄膜污染[7]和蒽污染[8]均有很好地降解作用。利用煙曲霉高效的生物降解能力及其次生代謝產(chǎn)物的高生物活性，以再利用的農(nóng)作物秸稈作為碳氮源制成的煙曲霉具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1?果樹生產(chǎn)的安全性

1.1?活體煙曲霉的鑒定

煙曲霉是否安全，首先要對(duì)果樹內(nèi)的真菌進(jìn)行培養(yǎng)分離鑒定。煙曲霉活體菌株的檢測(cè)方法主要以真菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段進(jìn)行。

不同地區(qū)的煙曲霉在真菌形態(tài)學(xué)上趨于一致：致密圓柱形的分生孢子頭、頂囊的形狀和分生孢子的特征，因此基于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)形態(tài)、顏色、顯微形態(tài)以及色素形成等情況，在加上通過鏡檢可以基本判斷適合一些像煙曲霉比較常見的菌株。平板培養(yǎng)觀察煙曲霉菌落有輻射狀皺紋，非標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲根據(jù)底物營(yíng)養(yǎng)不同，呈青黃色到煙土色不一。鏡檢下，煙曲霉產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)有類似的傘狀結(jié)構(gòu)，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，菌絲有隔，分生孢子球形。孢子體積較小，在空氣中易飄散，普通光學(xué)顯微鏡須在放大1 000倍（100×10）下能夠清楚觀察到孢子形態(tài)。這樣的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法觀察則比較簡(jiǎn)單方便。

利用分子生物學(xué)檢查也是目前最常用的手段，菌株的鑒定不會(huì)受到實(shí)驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)水平影響，比較客觀[9]。并且煙曲霉基因序列相對(duì)保守[10]，一般采用rDNA-ITS序列分析即可鑒定菌種。

1.2?次生代謝產(chǎn)物的安全性

煙曲霉活體菌株鑒定雖然解決的菌種定性的問題，但無法區(qū)分是否為帶毒菌株。煙曲霉有毒的次生代謝產(chǎn)物多以震顫真菌毒素（Verruculogen）、煙曲霉震顫素B（Fumitremorgin B）、膠毒霉素（Gliotoxin）等為標(biāo)志化合物，這些代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)獨(dú)特，利用色譜、光譜和質(zhì)譜技術(shù)定性分析，或利用核磁共振技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，可作為帶毒菌株的定性分析，但使用和維護(hù)費(fèi)用較為昂貴。

目前，真菌毒素在食品原料和（或）食品成品可食用部分中允許的最大含量水平在0.5～60 μg/kg[11]。以煙曲霉中的膠毒霉素為例，其產(chǎn)量約在15 mg/L[12]，控制水量稀釋800～1 000倍制成對(duì)有助于保證次生代謝產(chǎn)物在果樹生產(chǎn)的安全性。

1.3?生產(chǎn)環(huán)境的安全性

煙曲霉一直被認(rèn)為對(duì)人和牲畜較為危險(xiǎn)的致病真菌[13]，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)常用于曲霉病發(fā)病機(jī)制的模型建立[14，15]，但從果樹生產(chǎn)環(huán)境的角度看，作為天然存在的菌種，煙曲霉其本身是被投放在湖水中，已證明結(jié)果較為安全[16]。從果樹本身角度看，煙曲霉作為植物內(nèi)生菌群之一，在正常生長(zhǎng)的農(nóng)作植物中能夠分離得到煙曲霉[17]。果樹生產(chǎn)環(huán)境相對(duì)開放，并且在煙曲霉在植株生長(zhǎng)中并未有明顯的毒害作用，同時(shí)作為非靶生物的人和牲畜一般認(rèn)為是在低抵抗力的情況下受到煙曲霉孢子侵犯得病[18]，使得煙曲霉在果樹生產(chǎn)上的安全利用存在可操作性。

2?農(nóng)作物秸稈再利用

2.1?煙曲霉的馴化和保存

煙曲霉對(duì)農(nóng)作物秸稈生物轉(zhuǎn)化能力比較強(qiáng)，可采用菌株馴化篩選的方法[19]，將察氏固體培養(yǎng)基中的碳源蔗糖（或葡萄糖）按比例逐步兌換為果樹秸稈粉，將最后用純農(nóng)作物秸稈粉培養(yǎng)的煙曲霉作為種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)基其他成分可采用察氏固體培養(yǎng)基配方，進(jìn)行至少90 d的固體培養(yǎng)。當(dāng)固體培養(yǎng)基至瓶?jī)?nèi)顏色開始出現(xiàn)青色時(shí)，將其作為原菌種封口冷凍保存。

2.2?煙曲霉的擴(kuò)大培養(yǎng)

活化的固體培養(yǎng)基可以轉(zhuǎn)接菌絲和基質(zhì)到裝有培養(yǎng)液，培養(yǎng)液成分除瓊脂外與種子培養(yǎng)基保持一致，參考條件控制在30 ℃以上，轉(zhuǎn)速120 rpm以上，培養(yǎng)至少30 d以上，以獲得母液。培養(yǎng)初期液體培養(yǎng)基呈白色或淡黃色，菌體形狀不規(guī)則但明顯，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，色素慢慢累積呈青綠色，培養(yǎng)基液體顏色也呈現(xiàn)黃色。通過母液多批次接種獲得成規(guī)模煙曲霉培養(yǎng)液，每批次培養(yǎng)至少30 d以上，待菌團(tuán)或菌絲變大變多后，采用3層紗布過濾獲得。

2.3?煙曲霉的性狀特點(diǎn)

將煙曲霉用水稀釋800～1 000倍，制得煙曲霉，現(xiàn)配現(xiàn)用。該制劑呈淡黃色，包含煙曲霉孢子、菌絲體和秸稈顆粒等不溶物。煙曲霉中代謝產(chǎn)物主要活性成分為小分子生物堿[20]和有機(jī)酸[21]，因此可通過紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定總生物堿[22]和有機(jī)酸[23]的含量。

3?潛在應(yīng)用價(jià)值

3.1?增加土壤肥力

煙曲霉可以以農(nóng)作物秸稈粉為底物，煙曲霉發(fā)酵得到代謝產(chǎn)物。煙曲霉的原料底物秸稈中含有碳、氮、磷、鉀等元素，通常情況下纖維素、半纖維素和木質(zhì)素難以短時(shí)間降解，并且若直接在田間腐熟，未完全腐熟情況下容易產(chǎn)生大量病菌和蟲卵;煙曲霉能產(chǎn)生多種酶，如纖維素酶、木聚糖酶、淀粉糖化酶和β-1，6-葡聚糖酶等，對(duì)稻草[24]、玉米[25]、棉[26]等果樹秸稈均能作為碳源利用和降解。

3.2?減少果樹病蟲侵害

煙曲霉中存在對(duì)稻瘟病、紋枯病或赤星病病原真菌有抑菌效果的生物堿和有機(jī)酸，包括煙曲霉酸、12β-羥基-13α-甲氧基黃霉素TR-2、震顫真菌毒素和煙曲霉震顫素B等，這些次生代謝產(chǎn)物在實(shí)驗(yàn)室條件下的抗病效果均與廣譜殺菌劑多菌靈（Carbendazim）或惡霉靈（Hymexazol）相當(dāng)[27]。另外，煙曲霉中存在煙曲霉誘導(dǎo)的胞外幾丁質(zhì)酶，也可能產(chǎn)生意想不到的效果[28]。目前，商品化的幾丁質(zhì)殺蟲劑Clandosan在美國(guó)已經(jīng)應(yīng)用于園藝植物。該產(chǎn)品宣傳可以促進(jìn)土壤微生物產(chǎn)生一種殺死線蟲和蟲卵的幾丁質(zhì)酶，以致殺滅根瘤線蟲（Meloidogyne spp.）[29]。而煙曲霉本身能夠分泌幾丁質(zhì)酶，因此，施用煙曲霉在土壤中可能有直接防治害蟲或者與其他微生物協(xié)同防治的潛力。

3.3?降低果樹環(huán)境污染

煙曲霉中存在低劑量煙曲霉孢子和菌絲可能起到煙曲霉的生物降解作用。在實(shí)驗(yàn)室條件下已經(jīng)證明煙曲霉對(duì)甲胺磷[4]、阿特拉津[5]、西瑪津[5，6]等農(nóng)藥有降解能力，并且能夠降解小分子聚乙烯薄膜殘?bào)w，在“光照+煙曲霉”綜合降解模式下可縮短農(nóng)用薄膜的降解周期[7]。

4?展望

煙曲霉有毒次生代謝產(chǎn)物多為環(huán)境因素影響。比如在高濃度氯化鈉脅迫條件下，煙曲霉代謝大量產(chǎn)生膠毒霉素（Gliotoxin）[12]。一方面，通過去毒提取工藝和產(chǎn)毒機(jī)理研究，可以提高利用煙曲霉的安全性。如何讓煙曲霉本身減毒或是通過層析等分離方法將其去毒，這需要嘗試。比如采用兩步發(fā)酵制有機(jī)肥法，

第1步采用煙曲霉處理底物，第2步采用其他菌株處理煙曲霉代謝產(chǎn)物，這是一種很好的減毒探索方法[30]。再比如可以通過基因敲除、紫外誘變或抗性篩選尋找弱毒菌株，也是未來發(fā)揮高濃度煙曲霉高酶活和次生代謝產(chǎn)物的研究途徑。另一方面，稀釋倍數(shù)有利于避免微生物危險(xiǎn)[31]，保證對(duì)環(huán)境相對(duì)親和，為田間試用提供實(shí)際操作的可能。煙曲霉基于生化特點(diǎn)，以往煙曲霉基本處于配角中，比如有機(jī)肥中添加適量煙曲霉發(fā)酵被認(rèn)為是有助于制備新的生物有機(jī)肥[32];空氣中帶有煙曲霉孢子的混合菌種出現(xiàn)在我國(guó)某些傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中如某些釀酒、豆豉、腐乳中[33]。煙曲霉與人類的關(guān)系密切，需要理性看待其危害，其本身的經(jīng)濟(jì)價(jià)值尚待我們開發(fā)。

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