新疆南疆邊境地區(qū)優(yōu)勢(shì)蜱種及其基因多樣性分析

唐莉娟，劉 丹，卜三平

巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆庫(kù)爾勒 841000

蜱主要寄生于動(dòng)物體表，可通過(guò)直接叮咬傳播疾病。據(jù)報(bào)道,世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了900多種蜱。目前我國(guó)共計(jì)121種硬蜱科,10種軟蜱科,但沒(méi)有納蜱。通過(guò)蜱蟲能夠傳播的病原體：病毒大約有126種、立克次體至少20種、原蟲和衣原體32種等。因此,加強(qiáng)對(duì)蜱傳疾病的相關(guān)研究是十分必要且刻不容緩的。

新疆是中國(guó)陸地邊境線最長(zhǎng)的省份之一，南疆地區(qū)就與吉爾吉斯斯坦、巴基斯坦、塔吉克斯坦、阿富汗、印度五個(gè)國(guó)家接壤。新疆除了擁有經(jīng)濟(jì)地理位置的優(yōu)勢(shì)之外,還擁有這一廣袤地區(qū)獨(dú)特的地理景觀以及豐富多樣的物種。因此,其體表蜱種受復(fù)雜的地理景觀影響豐富而又獨(dú)特,同時(shí)這些蜱種也是蜱傳疾病的媒介生物。但新疆地區(qū)(尤其是南疆)關(guān)于蜱傳病毒、細(xì)菌和寄生蟲種類和分子流行情況等本底數(shù)據(jù)仍不清楚。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)新疆南疆邊境地區(qū)蜱傳疾病有利于國(guó)際間傳染病“聯(lián)防聯(lián)控”數(shù)據(jù)的共享。

1 材料與方法

1.1 蜱的采集

201 9年3月～2020年6月,在新疆南疆皮山縣、葉城縣、烏什縣、烏恰縣、拜城縣5個(gè)縣市共采集家畜體表寄生蜱和游離蜱528只。將采集的蜱按采集時(shí)間和地點(diǎn)分類并且詳細(xì)標(biāo)記蜱蟲的數(shù)量、蜱的狀態(tài)(死蜱、活蜱、飽血蜱以及非飽血蜱)和宿主。

1.2 蜱形態(tài)學(xué)鑒定分析

使用普通光學(xué)顯微鏡和體視解剖顯微鏡對(duì)采集到的蜱蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，鑒定標(biāo)準(zhǔn)主要參照Walker主編的《寄生蜱鑒定指南》[1]和于心主編的《新疆蜱類志》[2]，

1.3 蜱種分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 引物設(shè)計(jì)：通過(guò)閱讀大量文獻(xiàn)以及本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)蜱蟲的研究成果，最終決定參考文獻(xiàn)中的已知引物，委托上海祥音生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.2 PCR擴(kuò)增：PCR總反應(yīng)體系25 μL：DNA模板1.5 μL，引物PF、PR各2 μL，10×PCR Buffer 2.4 μL，d NTP 2 μL，rTap酶0.6 μL，去離子水16.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,37個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min。ddH2O為陰性對(duì)照,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察檢測(cè)目的片段的大小。

2 結(jié)果

2.1 各縣市蜱數(shù)量以及蜱種構(gòu)成

本調(diào)查5個(gè)南疆縣市共采集528只蜱蟲，采樣結(jié)果顯示均為圖蘭扇頭蜱。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

16S rDNA、12S rDNA和COI基因片段由普通PCR擴(kuò)增，蜱種擴(kuò)增的片段分別在460 bp、400 bp和890 bp左右的位置出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期片段的大小一致。

2.3 蜱線粒體基因擴(kuò)增序列分析

比對(duì)擴(kuò)增到的蜱線粒體基因序列，可以證實(shí)本次采集到的5個(gè)縣市的寄生蜱分子生物學(xué)分析與形態(tài)學(xué)方法鑒定結(jié)果一致,均為圖蘭扇頭蜱。

2.4 蜱種系統(tǒng)發(fā)育分析（見(jiàn)圖1）

圖1 基于16S rDNA基因蜱種系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

3 討論

蜱分為硬蜱科、軟蜱科和納蜱科三個(gè)科，截至目前為止，世界上蜱類有3科18屬約900種。其中，中國(guó)蜱類有2科10屬121種。一些學(xué)者主要調(diào)查分析了新疆各地區(qū)蜱類分布相關(guān)情況，所得結(jié)果有較高的參考價(jià)值。如王光雷等調(diào)查分析了1995年青河縣暴發(fā)的蜱傳疾病相關(guān)情況，結(jié)果表明此次蜱害的蜱種為草原革蜱；巴音查汗等對(duì)新疆和靜縣牦牛體表寄生的硬蜱進(jìn)行了鑒定及分析，其優(yōu)勢(shì)蜱種主要包括銀盾革蜱、草原革蜱、小亞璃眼蜱、丹氏血蜱和微小牛蜱；2006年，阿不力克木·阿布都熱西提等對(duì)塔里木盆地蜱類的群落進(jìn)行了分析研究，共采集獲得5屬10種蜱，其中只有拉合爾鈍緣蜱一種為軟蜱，其他均為硬蜱。然而，針對(duì)新疆南疆地區(qū)的蜱類調(diào)查至今缺乏比較全面系統(tǒng)的調(diào)查。本次采樣調(diào)查主要選擇了南疆地區(qū)的5個(gè)縣市,對(duì)南疆地區(qū)蜱蟲分布研究有著重要意義。

南疆地區(qū)自然植被的地點(diǎn)主要是平原植被稀疏，山地垂直帶明顯，不同環(huán)境形成不同植物群落。本次采集的蜱種分布的地理環(huán)境主要是荒漠半荒漠草原、荒漠沙丘、沙漠綠洲等，蜱種分布主要為圖蘭扇頭蜱,證實(shí)了前期學(xué)者關(guān)于圖蘭扇頭蜱是新疆優(yōu)勢(shì)蜱種的結(jié)論。通過(guò)序列比對(duì)結(jié)果顯示：本研究獲得圖蘭扇頭蜱線粒體16S rDNA基因片段與基因庫(kù)對(duì)應(yīng)的蜱種同源性可達(dá)99.02%～100%，該結(jié)果證實(shí)了新疆南疆地區(qū)家畜體表寄生的主要蜱種是圖蘭扇頭蜱。使用Mega 6.06軟件基于16S rDNA基因的NJ樹分析得知，本研究采集到的圖蘭扇頭蜱與阿克蘇、阿拉爾采集的圖蘭扇頭蜱處與同一分支，但各采樣采集到的圖蘭扇頭蜱16S rDNA基因序列有所差異，存在顯著的基因多樣性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)今后繼續(xù)開(kāi)展南疆地區(qū)蜱傳病原及蜱種基因多樣性研究具有重要意義。