超聲波輔助提取玉木耳多糖及其抗氧化活性分析

吳玉柱,崔維建,李 妍

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室,吉林長春 130118)

玉木耳(AuriculariacorneaEhrenb.)[1]是吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)李玉院士團(tuán)隊從毛木耳菌株中分離純化、馴化栽培而形成穩(wěn)定遺傳結(jié)構(gòu)的天然變異菌株,玉木耳耳片通體白色,肉質(zhì)滑嫩,味道鮮美,含有豐富的營養(yǎng)和藥用價值,其中多糖6.56%,粗脂肪2.7%,粗蛋白7.3%,不飽和脂肪酸6.22%,可食性膳食纖維35.1%,富含17種氨基酸,在木耳中有“白富美”之稱[2-4]。目前已在吉林、遼寧、河南、山東、江蘇、浙江、新疆、廣西等省市及自治區(qū)推廣,并獲得良好經(jīng)濟(jì)效益[5]。

研究表明,食用菌之所以具有良好的藥用價值,與富含的多糖類物質(zhì)密切相關(guān)。傳統(tǒng)的多糖提取方法與加熱或煮沸有關(guān)[6-7]。但這些技術(shù)通常提取產(chǎn)率較低,并且需要大量的溶劑、較長的提取時間或較高的提取溫度。當(dāng)長時間且高溫下進(jìn)行溶劑萃取時,多糖的結(jié)構(gòu)可能被破壞,生物活性也會下降或完全消失。近年來,超聲波輔助提取法被認(rèn)為是一種溫和、高效、節(jié)能和環(huán)保的方法,已廣泛應(yīng)用于多糖的提取過程[8-9]。目前已有幾位學(xué)者研究了玉木耳多糖的提取與活性分析,引起了人們的廣泛關(guān)注,如金鳳石[10]采用高溫高壓法提取了玉木耳多糖并研制玉木耳抗疲勞飲料;王秀秀[11]采用熱水提取和蝸牛酶提取法提取玉木耳多糖并證明其有抗氧化抗炎癥和保肝作用;羅敬文等[12]利用水提醇沉法得到玉木耳多糖并測定了其羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基和亞硝酸根離子清除能力。但相比于黑木耳與毛木耳的研究[13-14],現(xiàn)階段玉木耳多糖藥理活性的相關(guān)報道仍較少且不夠深入,還需補(bǔ)充大量數(shù)據(jù)及驗(yàn)證,未見超聲波輔助法及FRAP、ORAC等體外抗氧化能力測試。

本研究采用超聲波輔助提取法提取玉木耳多糖,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝,采用傅里葉紅外光譜對玉木耳多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征,并分析其體外抗氧化能力,以期為超聲波輔助提取玉木耳多糖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉木耳 食用菌國家工程實(shí)驗(yàn)室(吉林長春);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 北京博奧拓達(dá)科技有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)測試盒 南京建成生物工程研究所;水溶性維生素E(Trolox)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(2,2′-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,AAPH) 美國Sigma 公司;熒光素鈉(Fluorescein,disodium salt) 上海羅恩試劑;無水葡萄糖、正丁醇、三氯甲烷、苯酚、濃硫酸、無水乙醇等 均為分析純。

Spectramax190全波長酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;AllegraX-30離心機(jī) 美國BECKMA公司;電子分析天平 Sartorious(北京)有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;JH電動攪拌器 江蘇金壇市江南儀器廠;Alphal-4LDplus冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司;KQ5200DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉木耳多糖的提取 玉木耳洗凈后,烘干、粉碎并過60目篩,在室溫下,置于80%乙醇中浸提4 h,以除去其中單糖、低聚糖及有色物質(zhì)[15]。完成后以4000 r/min離心10 min,將沉淀物干燥得到玉木耳粉,放置于干燥器中備用。稱取玉木耳粉,按一定液料比加入蒸餾水,在設(shè)計的超聲條件下進(jìn)行提取。提取完成后,冷卻至室溫,以4500 r/min離心15 min,洗滌沉淀,合并上清液,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在65 ℃條件下濃縮至初始體積的1/4,加入無水乙醇至最終濃度為80%,在4 ℃條件下靜置過夜[16],以4500 r/min離心10 min并收集沉淀物,利用Sevag法除蛋白,冷凍干燥后得到玉木耳多糖。

1.2.2 玉木耳多糖得率計算

1.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 按照苯酚-硫酸法顯色法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[17],將100 mg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為不同濃度的待測液,于490 nm處測定溶液的吸光值,繪制以吸光度值為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出的回歸方程為:y=10.056x-0.0216,R2=0.9985,線性關(guān)系良好。

1.2.2.2 玉木耳多糖含量測定及得率計算 按照1.2.1試驗(yàn)方法提取玉木耳多糖,提取液分別加蒸餾水定容至100 mL,吸取1 mL稀釋液,采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定。

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算多糖含量,多糖得率計算方法如下:

式中:c為樣品稀釋液中多糖的濃度(mg/mL);n為稀釋倍數(shù);V為樣品測定液體積(mL);m為玉木耳粉質(zhì)量(mg)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計 按照1.2.1節(jié)的方法,提取條件為:固定超聲功率180 W,超聲溫度60 ℃和超聲時間20 min,考察液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g)對玉木耳多糖得率的影響;固定液料比40∶1 mL/g、超聲溫度60 ℃和超聲時間20 min,考察超聲功率(120、150、180、210、240 W)對玉木耳多糖得率的影響;固定液料比40∶1 mL/g、超聲功率180 W和超聲時間20 min,考察超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃)對玉木耳多糖得率的影響;固定液料比40∶1 mL/g、超聲功率180 W和超聲溫度60 ℃,考察超聲時間(10、20、30、40、50 min)對玉木耳多糖得率的影響。每組試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇液料比(A)、超聲功率(B)、超聲溫度(C)、超聲時間(D)為自變量,以多糖得率為響應(yīng)值(Y),根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理,采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計,優(yōu)化超聲波輔助提取玉木耳多糖的工藝,因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計因素與水平

1.2.5 傅里葉紅外光譜分析(FT-IR) 根據(jù)Zhao等[18]的方法稍作修改進(jìn)行FT-IR測試。稱取1.5 mg超聲波輔助提取法制備的玉木耳多糖樣品于瑪瑙研缽中,加入100 mg溴化鉀粉末并置于紅外燈下研磨均勻,然后壓成薄片,掃描范圍400～400 cm-1,使用熱水浸提法得到的玉木耳多糖作為對照(提取條件:液料比40∶1 mL/g,浸提溫度95 ℃,提取時間120 min),記錄樣品的FT-IR光譜。

1.2.6 玉木耳多糖體外抗氧化活性試驗(yàn)

1.2.6.1 DPPH自由基清除試驗(yàn) 根據(jù)Zhou等[19]報道的方法,對DPPH自由基的清除作用進(jìn)行分析。吸取2 mL稀釋為不同質(zhì)量濃度的樣品溶液,加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中,混勻,在室溫黑暗條件下保持30 min,在517 nm處測量溶液的吸光度,用VC標(biāo)準(zhǔn)品作為對照組。DPPH自由基清除率計算如下:

式中,A0為對照反應(yīng)(DPPH)的吸光度,A1為加入樣品時的吸光度。

1.2.6.2 鐵離子還原能力的測定(FRAP法) 根據(jù)試劑盒中檢測方法[20]。準(zhǔn)確稱取玉木耳多糖,加入4倍體積的PBS溶液(10 mmol/L,pH7.0),充分溶解,離心(4 ℃,12000 r/min,5 min)取上清液作為待測液。在96孔板中加入180 μL FRAP工作液和5 μL待測液后輕輕混勻,37 ℃孵育5 min,測定其在593 nm波長處吸光度,FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.2117x+4.2144×10-5,R2=0.9991。樣品總抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度所需FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示(mmol/L)。

1.2.6.3 氧自由基吸收能力的測定(ORAC法) 參考Huang等[21]方法并加以改進(jìn)。向96孔板(黑板)中加入25 μL樣品后放入預(yù)熱好的酶標(biāo)儀中,37 ℃溫育10 min后加入150 μL熒光素鈉工作液,混勻溫育20 min后加入25 μL AAPH溶液(0.125 g/mL),以激發(fā)波長490 nm、發(fā)射波長530 nm連續(xù)測定熒光強(qiáng)度。計算空白(無AAPH)和每個樣品之間的熒光素衰減曲線下的面積(凈面積)的差值。以Trolox系列濃度的函數(shù)凈面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.4264x-0.7951,R2=0.9944,樣品抗氧化能力表示為mg Trolox/mg。

1.2.7 統(tǒng)計分析 試驗(yàn)均重復(fù)3次,使用Origin 2018軟件繪圖,采用OMNIC 8.0軟件及Design-Expert 8.0.6軟件處理數(shù)據(jù),通過ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對玉木耳多糖得率的影響 多糖等大分子在水中溶解度與液料比密切相關(guān)。料液比對玉木耳多糖得率的影響如圖1所示。液料比較低時,溶液黏度較高不利于多糖擴(kuò)散,隨著液料比的增大,多糖得率逐漸增大,在料液比為40∶1 (mL/g)時達(dá)到最大值7.03%,隨后得率降低。可見料液比越大,可容納的多糖分子越多,但并不能無限增多,過大的液料比還會增加后期濃縮和醇沉的能耗與工作量,從而增加玉木耳多糖的提取成本。因此，液料比選擇為40∶1 (mL/g)。

圖1 液料比對玉木耳多糖得率的影響

2.1.2 超聲功率對玉木耳多糖得率的影響 圖2為超聲功率對玉木耳多糖得率的影響。當(dāng)功率從120 W增加到210 W時,玉木耳多糖的得率顯著增加,且?guī)缀蹙€性增加到7.14%,當(dāng)超聲功率超過210 W時,多糖得率下降。這可能是由于超聲功率的增大有助于液固兩相的相互混合和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破碎,但功率過強(qiáng)時,超聲波空化作用加大,機(jī)械力增強(qiáng),多糖結(jié)構(gòu)可能遭到破壞,多糖的得率降低[22]。因此，超聲功率選擇為210 W。

圖2 超聲功率對玉木耳多糖得率的影響

2.1.3 超聲溫度對玉木耳多糖得率的影響 溫度過低時,分子運(yùn)動速度較慢,多糖無法充分溶出,當(dāng)溫度升高,分子運(yùn)動速率加快,多糖溶解度增加。如圖3所示,隨溫度升高,溶液原料間的相互作用加速,細(xì)胞結(jié)構(gòu)更好地被破壞,多糖更有效地溶出,得率最大可達(dá)7.16%,但當(dāng)提取溫度高于60 ℃時,得率出現(xiàn)下降的趨勢,可能是溫度過高使部分糖鏈發(fā)生斷裂。因此,玉木耳多糖的提取溫度可控制在60 ℃左右。

圖3 超聲溫度對玉木耳多糖得率的影響

2.1.4 超聲時間對玉木耳多糖得率的影響 超聲時間的變化影響了多糖的得率,玉木耳多糖得率在早期迅速增加,超聲時間為30 min時多糖得率達(dá)到最大值(圖4)。這可能是由于多糖暴露在釋放介質(zhì)中的時間要求,液體滲透到干燥的原料中,溶解多糖,然后從原料中擴(kuò)散出來,較長的提取時間有利于多糖的產(chǎn)生,但是,超聲時間過長可使超聲空化作用增強(qiáng),機(jī)械力增大,溫度上升,從而將已溶出的多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞[23]。因此，超聲時間選擇為30 min。

圖4 超聲時間對玉木耳多糖得率的影響

2.2 玉木耳多糖提取工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 模型方程建立與顯著性檢驗(yàn) 選擇液料比(A)、超聲功率(B)、超聲溫度(C)及超聲時間(D)為影響因素,以得率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計,得到的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計分析結(jié)果如表2所示(實(shí)測值為3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值),利用Design-Expert 8.0.6軟件分析處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),可以得到回歸方程為Y=7.48+0.14A+0.25B+0.21C+0.14D-0.035AB-0.063AC-0.55AD+0.40BC-0.25BD-0.63CD-0.86A2-1.03B2-0.93C2-0.35D2。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)回歸模型方程進(jìn)行方差分析結(jié)果見表3。模型P<0.0001,說明回歸模型對多糖得率的結(jié)果達(dá)到極顯著水平,試驗(yàn)設(shè)計可靠。失擬項(xiàng)P=0.1023>0.05,表明模型計算結(jié)果與檢驗(yàn)結(jié)果的差異不顯著。模型線性決定系數(shù)R2=0.9804,變化系數(shù)CV=2.60,表明試驗(yàn)的預(yù)測值和實(shí)際值相關(guān)度高,多糖提取率的回歸模型擬合度較好,可以用于響應(yīng)值的預(yù)測。從表3中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知,回歸模型二次項(xiàng)中的B、C、D、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2(P<0.01)達(dá)到極顯著水平以及A達(dá)到顯著水平(P<0.05),AB與AC不顯著(P>0.05)。根據(jù)F值可以得出,四個因素對玉木耳多糖得率的影響大小順序?yàn)?超聲功率>超聲溫度>超聲時間>液料比。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用影響結(jié)果 等高線圖、響應(yīng)面圖可以直觀地反映兩因素間的交互作用。響應(yīng)面圖越陡說明兩自變量的交互作用對響應(yīng)值影響程度越大,相反,越平緩交互作用影響越不顯著[24]。等高線圖越偏離圓形，交互影響越強(qiáng),反之,越接近圓形，交互影響越弱。由圖5分析得出,AD、BC、BD、CD響應(yīng)面3D圖陡峭,且等高線圖呈明顯的橢圓形,因此交互作用顯著,AB與AC等高線圖接近圓形,表明交互作用不顯著(P>0.05),這與方差結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

表3 回歸方程方差分析表

2.2.3 最優(yōu)條件的確定與回歸模型的驗(yàn)證 通過試驗(yàn)分析,確定超聲波輔助法提取玉木耳多糖的最佳提取工藝為液料比41.03∶1 mL/g,超聲功率215 W,超聲溫度61.8 ℃,超聲時間28.91 min,此條件下玉木耳多糖得率為7.52%?？紤]到實(shí)際操作的簡便性和可行性,將提取條件調(diào)整為:液料比40∶1 mL/g,超聲功率210 W,超聲溫度62 ℃,超聲時間29 min,此工藝條件下進(jìn)行超聲波輔助法提取玉木耳多糖,試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值,得率為7.43%。結(jié)果與預(yù)測值誤差較小,表明優(yōu)化后的工藝條件準(zhǔn)確可靠,具有一定的應(yīng)用價值。

2.3 傅里葉紅外變換光譜分析

紅外吸收光譜是分析多糖等化合物結(jié)構(gòu)的重要方法之一,依據(jù)吸收峰的位置和形狀能夠獲得糖鏈上的官能團(tuán)類型和糖環(huán)構(gòu)型等結(jié)構(gòu)信息[25]。如圖6所示,紅外光譜表明超聲波處理未改變玉木耳多糖的結(jié)構(gòu)。玉木耳多糖具有糖類化合物特征吸收峰,其中在3367 cm-1處的吸收峰是O-H伸縮振動引起的,峰形強(qiáng)而寬,說明存在分子間氫鍵。2931 cm-1處是飽和C-H的伸縮振動吸收峰,1645和1423 cm-1可分別對應(yīng)于糖醛酸中的羰基C=O振動和羰基C-O伸縮振動,這表明玉木耳多糖是酸性多糖[26];1374 cm-1是甲基C-H彎曲振動吸收峰,與C-H的伸縮振動構(gòu)成了糖環(huán)的特征吸收[27],1248 cm-1處為-COOH中O-H鍵伸縮振動,1040 cm-1處是C-O的伸縮振動峰,說明多糖中含有吡喃糖環(huán)。在895 cm-1處出現(xiàn)的小峰,推測是由次甲基的橫向振動引起的,說明其中含有β-型糖苷鍵[28]。

圖6 玉木耳多糖傅里葉變換紅外光譜

2.4 體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH·是一種非常穩(wěn)定的自由基,以氮為中心,在517 nm處具有強(qiáng)吸收,通常用于檢測抗氧化能力。由圖7可知,玉木耳多糖及VC對DPPH自由基清除能力隨質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng),并且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,在濃度為1.0 mg/mL 時,玉木耳多糖的DPPH自由基清除率達(dá)到43.36%,低于1.0 mg/mL VC97.35%的清除率,當(dāng)玉木耳多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時,自由基清除率達(dá)到74.83%,這高于Zeng等[29]純化后的黑木耳多糖抗氧化能力,且與王秀秀[11]和羅敬文等[12]的研究結(jié)果相近。采用半數(shù)抑制率(IC50)定義為清除自由基達(dá)50%時的樣品濃度。經(jīng)曲線擬合方程計算求得玉木耳多糖的IC50值為1.445 mg/mL,陽性對照VC的IC50值為0.062 mg/mL。在本試驗(yàn)測試的濃度范圍內(nèi),盡管玉木耳多糖的DPPH自由基清除活性不如VC強(qiáng),但仍具有有效清除能力,可作為天然抗氧化劑應(yīng)用。

圖7 玉木耳多糖的DPPH自由基清除能力

2.4.2 FRAP及ORAC抗氧化試驗(yàn)結(jié)果 Fe3+-TPTZ在酸性條件下可被樣品中還原物質(zhì)還原為Fe2+-TPTZ,呈現(xiàn)出藍(lán)色,并于593 nm處具有最大光吸收,根據(jù)吸光度大小計算樣品抗氧化活性的強(qiáng)弱[30]。氧自由基清除能力法(ORAC)的原理是AAPH自由基破壞熒光素鈉,使熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。而抗氧化劑可以延緩AAPH自由基引起的熒光強(qiáng)度變化,其抑制程度反映了對自由基的清除能力大小,ORAC值越大,表示其抗氧化的能力越強(qiáng)[21]。由表4可知,玉木耳多糖具有有效的鐵離子還原能力,且在試驗(yàn)測試濃度下,玉木耳多糖的ORAC值(0.627 mg Trolox mg-1)接近VC的ORAC值(0.710 mg Trolox mg-1),表明玉木耳多糖具有較好的抗氧化能力。

表4 玉木耳多糖的FRAP還原能力與氧自由基清除能力

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取了玉木耳多糖,并利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行優(yōu)化,得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為液料比40∶1 mL/g,超聲功率210 W,超聲溫度62 ℃,超聲時間29 min,此工藝條件下玉木耳多糖的得率為7.43%。超聲波輔助提取法得到的玉木耳多糖具有多糖類特征吸收峰,為以β-糖苷鍵為主的吡喃型多糖。三種體外抗氧化試驗(yàn)的結(jié)果均顯示,玉木耳多糖具有很好的抗氧化活性,可作為潛在的天然抗氧化劑應(yīng)用于功能性食品、醫(yī)藥、保健食品領(lǐng)域。