白骨壤內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其抑菌活性分析

倪 婕，李 菲，李雨霖，陸 璐，3，謝一嘉，劉小玲，余 煉*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西科學(xué)院/廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點實驗室，廣西 南寧 530007；3.廣西科學(xué)院廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點實驗室培育基地，廣西 南寧 530007)

【研究意義】紅樹林(Mangrove)分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種處于海洋和陸地過渡帶的特殊生態(tài)系統(tǒng)，包括紅樹植物、細(xì)菌、真菌、微藻、鳥類、無脊椎動物和哺乳動物等類群[1]。該生境的紅樹植物頻繁遭受潮汐淹沒和強(qiáng)紫外線照射，致使其根部處于間歇性缺氧狀態(tài)[2]。其中，內(nèi)生菌作為紅樹植物的重要組成部分，其種類豐富且數(shù)量龐大，在長期抵抗海洋高溫、高鹽、強(qiáng)風(fēng)、缺氧和強(qiáng)紫外線等惡劣條件的過程中，其遺傳物質(zhì)得到不斷適應(yīng)和進(jìn)化[3]，因而相比于陸生來源的微生物，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特殊、抗菌作用機(jī)制新穎，是新型海洋藥用先導(dǎo)化合物的重要來源[4]。白骨壤(Avicenniamarina)又名海欖雌，為馬鞭草科灌木或小喬木，具有細(xì)棒狀的出水呼吸根，是紅樹林的優(yōu)勢樹種；葉片近無柄，革質(zhì)，呈黃綠色；果實為渾圓心形，俗稱“欖錢”[5]，具有根系發(fā)達(dá)、生長快速、對惡劣環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點，富含可產(chǎn)生抗生素、防腐劑和酶等活性物質(zhì)的內(nèi)生菌[6]。白骨壤作為藥用植物資源，可用于治療瘧疾、風(fēng)濕、哮喘、天花和潰瘍等多種疾病[7]，藥理學(xué)實驗顯示，其所含的二萜類、環(huán)烯醚萜和萘醌類等化合物具有改善癌癥、糖尿病、炎癥、腹瀉及氧化應(yīng)激等疾病的藥物特性[8]。白骨壤的內(nèi)生細(xì)菌與植物體互利共生，能產(chǎn)生與宿主相同的信號傳導(dǎo)通路，合成與宿主類似的活性次生產(chǎn)物，這些產(chǎn)物具有抑制植物病原菌[9]、抗衰老[10]及殺蟲[11]等功效。然而，目前鮮見對白骨壤各部位內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)分離鑒定的報道，其抑菌活性方面的用途也未得到充分發(fā)掘。因此，勘探白骨壤內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其生物學(xué)活性，對促進(jìn)紅樹林微生物資源的開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】靳鵬飛等[12]首次從白骨壤中分離到32株絲狀內(nèi)生真菌，其中有6株能顯著抑制金黃色葡萄球菌。陳振明等[9]從白骨壤中獲得13株內(nèi)生細(xì)菌，其中9株對黃瓜枯萎病菌具有拮抗作用。Viswanath等[13]從白骨壤根際分離到約800株細(xì)菌，其中55 %能分泌群體感應(yīng)信號分子AHL進(jìn)行群體交流和協(xié)調(diào)。Ali等[14]從白骨壤中分離出28株內(nèi)生細(xì)菌，其中有2株能顯著提高植物的鹽堿耐受性。Jiang等[15]對白骨壤各部位進(jìn)行放線菌分離篩選，共得到10株至少對1種ESKAPE病原體具有抑制作用的放線菌。李蜜等[11]從白骨壤中分離到14株內(nèi)生細(xì)菌，其中的Stenotrophomonasrhizophila具有延緩線蟲衰老能力?？梢姡t樹植物白骨壤的內(nèi)生菌具有豐富且獨特的物種多樣性，對研究和應(yīng)用其活性化合物資源意義重大。目前，將16S rRNA基因序列分析用于細(xì)菌分類和鑒定的研究越來越多，如：李飛娜等[16]從桐花樹、老鼠簕和秋茄等12種植物中共獲得192株內(nèi)生放線菌，經(jīng)16S rRNA基因序列分析，其潛在新種共有22株，放線菌資源新穎性高；江蕾等[17]對分離自海黃瓜的34株共附生細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因序列鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌隸屬于18科24屬；李小群等[18]從海芒果及其根際土壤中共分離得到15株可培養(yǎng)細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA基因序列分析，發(fā)現(xiàn)其分屬于厚壁菌門和放線菌門的發(fā)育類群?？梢姡?6S rRNA基因序列分析已成為微生物多樣性研究的重要工具?！颈狙芯壳腥朦c】廣西北侖河的白骨壤內(nèi)生細(xì)菌具有產(chǎn)生豐富活性代謝物質(zhì)的潛能，但目前針對該海域白骨壤各部位內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其抑菌活性的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】結(jié)合16S rRNA基因序列分析系統(tǒng)地研究白骨壤各部位可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，并分析這些內(nèi)生細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性，為充分利用紅樹植物內(nèi)生細(xì)菌資源和開發(fā)安全、高效的海洋藥物前體化合物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 白骨壤樣品 優(yōu)勢樹種白骨壤的根、皮、葉、花和果實樣品采集于廣西北部灣北侖河口紅樹林保護(hù)區(qū)(東經(jīng)108°16′30″，北緯21°35′00″)，置于無菌封口袋4 ℃保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 參考李小群等[18]、李菲等[19]的方法采用AGG、M4、M5、M7、M9、M10、M11、ISP2、ISP3、ISP7和PDA等11種分離培養(yǎng)基對白骨壤內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，其中發(fā)酵培養(yǎng)基為ISP2液體培養(yǎng)基。

1.1.3 菌株 指示菌啤酒酵母菌(SaccharomycescerevisiaeCICC 33032)、黑曲霉(AspergillusnigerCICC 2487)、擴(kuò)展青霉(PenicilliumexpansumCICC 40658)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCICC 20612)和埃希氏大腸桿菌(EscherichiacoliCICC 23657)由廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院微生物實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌分離純化及保藏 將完整無病害的白骨壤果實、花和葉等組織依次浸泡于0.5 %次氯酸鈉溶液和消毒酒精中滅菌各3 min，最后用無菌水沖洗3次，取1.0 g樣品與1.0 mL無菌水混合，經(jīng)組織研磨器研磨后，采用梯度稀釋法處理勻漿，各取0.2 mL 10-2和10-3稀釋度的樣液用涂布棒涂布均勻，多數(shù)菌落在28 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d長出，此時可進(jìn)行計數(shù)和分離。純化后的菌株以20 %(W/V)甘油為保藏劑，置于-80 ℃長期凍存。

1.2.2 16S rRNA基因序列鑒定 以27F和1492R為引物，采用Chelex-100法[20]提取白骨壤內(nèi)生菌株的總DNA作為PCR模板，PCR反應(yīng)體系和條件參考李菲等[1]的方法。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證目標(biāo)條帶后，委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司對擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。采用BioEdit軟件對測序結(jié)果進(jìn)行編輯整理后，將序列導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫EzBioCloud(https://www. ezbiocloud. net/)在線比對和進(jìn)行Clustal X多重比較。選擇與測序菌株同源性最高的菌種序列，利用MEGA 5.0和鄰位歸并法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹以推斷進(jìn)化關(guān)系[21]。

1.2.3 菌株發(fā)酵及次級代謝產(chǎn)物提取 采用裝有200 mL液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶制備發(fā)酵液，滅菌后接入1環(huán)對數(shù)生長期的菌體，在180 r/min、30 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d等待代謝產(chǎn)物充分產(chǎn)生。經(jīng)冷凍離心后棄菌體，用1∶1(V/V)乙酸乙酯充分萃取，于43 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮。依次用少量乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇和石油醚將次級代謝產(chǎn)物溶出，利用通風(fēng)櫥揮發(fā)至干，最后用2.0 mL DMSO溶液溶解備用。

1.2.4 菌株抑菌活性試驗 采用牛津杯法[22]測定分離菌株對1.1.3中5種指示菌的抑菌活性。將檢測菌濃度調(diào)至105～106CFU/mL制備檢測平板。每個牛津杯添加80.0 μl內(nèi)生細(xì)菌的次級代謝產(chǎn)物，以DMSO溶液為空白對照，在28 ℃下培養(yǎng)，待指示菌長出覆蓋平板后測量抑菌圈直徑。參考覃媚等[23]的標(biāo)準(zhǔn)判斷抑菌活性的強(qiáng)(抑菌圈直徑≥20 mm)、中等(抑菌圈直徑10～20 mm)和弱(抑菌圈直徑6～10 mm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析結(jié)果

根據(jù)菌落的顏色、形態(tài)、大小及生長時間等特征，在白骨壤的果實、根、皮、葉和花5個部位中共分離出61株細(xì)菌，隸屬于3門4綱12目16科20屬36種，其中，α-變形菌綱和γ-變形菌綱各8株，各占總菌株數(shù)的22.22 %；芽孢桿菌門8株，占總菌株數(shù)的22.22 %；放線菌門12株，占總菌株數(shù)的33.33 %，其中放線菌包括8個屬，分別為鏈霉菌屬、微單孢菌屬、角桿菌屬、假動球菌屬、棒狀桿菌屬、Sinomonassp.、微桿菌屬和戈登氏菌屬(表1)。說明放線菌是白骨壤內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢類群。

表1 白骨壤內(nèi)生細(xì)菌的組成

根據(jù)鑒定出的36株內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因序列，選擇與其最相似的參比菌株構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。從圖1可看出，菌株YA080與腸桿菌科的有效發(fā)表菌株P(guān)antoeaanthophilaLMG 2558T的相似率最低，為94.59 %；YA348與橙單胞菌科的有效發(fā)表菌株AurantimonascoralicidaDSM 14790T的相似率次之，為94.97 %。此外，菌株YA130與ThioclavapacificaDSM 10166T、YA204與SphingomonasaquatilisJSS7T、YA217與CorynebacteriumvariabileDSM 20132T、YA252與CorynebacteriumterpenotabidumDSM 20132T、YA265與SinomonassoliCW 59T及YA274與GordoniaterraeNBRC 100016T的相似度分別為95.93 %、96.05 %、96.95 %、97.01 %、97.90 %和96.47 %。以上8株菌株與模式菌的相似度低于98.65 %[24]，與各自所在菌科中序列相似的菌株在N-J系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上聚類為一簇?？梢姡?株菌株是其所在菌科中潛在的新分類單元，本研究中白骨壤的內(nèi)生細(xì)菌潛在新種率為22.22 %，且多為放線菌門，包括棒狀桿菌屬、Sinomonassp.和戈登氏菌屬。

圖1 白骨壤內(nèi)生細(xì)菌的N-J系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Neighbor-Joining tree of endophytic bacteria in A. marina

2.2 內(nèi)生細(xì)菌在各分離培養(yǎng)基及各組織部位的分布情況

從屬的水平對白骨壤花、果實、根、葉和皮的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行韋恩圖(圖2)分析，結(jié)果從各組織部位中均分離到Bacillussp.菌株，從花、皮和根中均分離到Pseudomonassp.菌株，從花和果實中均分離到Stakelamasp.和Acinetobactersp.菌株，從花和皮中均分離到Pantoeasp.和Mangrovibactersp.菌株，從果實和皮中均分離到Stakelamasp.菌株，從花和葉中均分離到Corynebacteriumsp.菌株。從圖2還可看出，從白骨壤各組織分離到的內(nèi)生細(xì)菌種屬數(shù)量排序為果實>花>皮>根=葉，在果實部位的內(nèi)生細(xì)菌屬最多，共10個屬，占總屬數(shù)的50.00 %，花次之，有9個屬，其后皮有7個屬，葉和根各有2個屬。說明在白骨壤的不同組織中，其內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量及種屬存在差異。

從圖3可看出，從不同培養(yǎng)基分離得到的種屬數(shù)與菌株數(shù)呈正比，獲得細(xì)菌數(shù)量較多的培養(yǎng)基其種屬數(shù)也較豐富。其中，AGG(改良高氏培養(yǎng)基)中內(nèi)生細(xì)菌的多樣性最豐富，共分離到8個菌屬，可作為分離培養(yǎng)基；從M11(棉子糖-組氨酸培養(yǎng)基)中分離到的菌株最少，僅1株。說明由不同培養(yǎng)基分離得到的白骨壤內(nèi)生細(xì)菌種屬數(shù)量有所不同。

2.3 白骨壤內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性分析結(jié)果

由表2可知，36株細(xì)菌均至少對1種病原菌具有抑制能力，其中，芽孢桿菌屬菌株YA001和YA304、鞘氨醇單胞菌屬YA257、假單胞菌屬YA265對5種病原菌具有抑菌活性；共有25株細(xì)菌對大腸桿菌具有抑菌活性，占總菌株數(shù)的69.44 %，尤其以YA350、YA304和YA124的次級代謝產(chǎn)物對大腸桿菌的抑制能力更強(qiáng)；枯草芽孢桿菌的活性菌株有28株，占總菌株數(shù)的77.78 %，尤其以YA350對枯草芽孢桿菌的抑制效果最佳；啤酒酵母的活性菌株有29株，占總菌株數(shù)的80.56 %；有26株細(xì)菌對擴(kuò)展青霉菌有抑制活性，占總菌株數(shù)的72.22 %，尤其以YA350的抑菌圈直徑達(dá)30.2 mm，在所有菌株中抑菌活性最明顯；有19株細(xì)菌對黑曲霉菌具有抑菌活性，占總菌株數(shù)的52.78 %，且從白骨壤中獲得的芽孢桿菌對黑曲霉均有抑制效果。說明白骨壤的部分內(nèi)生細(xì)菌對病原真菌和細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。

圖2 白骨壤各組織中內(nèi)生細(xì)菌屬級群類分布韋恩圖Fig.2 Venny of endophytic bacteria genera in A. marina

3 討 論

我國于2000年建立了廣西北部灣北侖河口國家級自然保護(hù)區(qū)，該區(qū)域擁有河口和海域等多種類型的海岸地貌，平均氣溫、降水量和土壤鹽分均適宜各物種生長繁殖，在遺傳結(jié)構(gòu)、物種組成和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性等方面具有其他海區(qū)無法比擬的優(yōu)勢，也因此蘊育了豐富的生物多樣性[25]。本研究從該地區(qū)的紅樹植物白骨壤組織中共分離到36株細(xì)菌，隸屬于3門4綱12目16科20屬36種，其中，屬于放線菌的有8個屬12株，是最優(yōu)勢類群，與Genilloud[26]研究指出產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的菌株中有約45 %是放線菌的觀點相似，說明白骨壤中的內(nèi)生放線菌資源豐富，產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的潛力巨大。在新穎性方面，本研究從北侖河口的紅樹植物白骨壤中共得到8株潛在新種，且多來自放線菌門，均勻分布于果實、花、葉和皮中，新種率為22.22 %，高于李菲等[1]從無瓣海桑中獲得菌株的潛在新種率(13.2 %)和李家怡等[27]從紅海欖中分離所得菌株的潛在新種率(17.6 %)，可能與白骨壤新陳代謝較快及耐鹽和耐淹水能力較強(qiáng)[28]有關(guān)，說明宿主對環(huán)境的高適應(yīng)能力更有利于孕育豐富的物種。

圖3 不同培養(yǎng)基分離得到的白骨壤內(nèi)生細(xì)菌數(shù)對比Fig.3 Endophytic bacteria numbers of A. marina isolated from different media

表2 36株白骨壤內(nèi)生細(xì)菌對5種指示菌的抑菌活性

本研究結(jié)果表明，從白骨壤的果實、花、根、皮和葉組織中均分離到Bacillussp.菌株，與Divya等[29]研究認(rèn)為芽孢桿菌具有易于生長及能適應(yīng)各種環(huán)境等特點的觀點一致；從白骨壤分離得到的內(nèi)生細(xì)菌在果實和花中分布居多，在根和葉中占少數(shù)，與李蜜等[10]、李菲等[1]、李家怡等[27]的研究結(jié)果存在較大差異，表明內(nèi)生菌的多樣性與宿主植物所處的季節(jié)、地理方位和生存環(huán)境等有關(guān)[30]，也表明內(nèi)生菌會隨著植株的生長發(fā)育將種子及根際中的內(nèi)生菌垂直轉(zhuǎn)移到花和果實中[31]。本研究的采樣時間在8月，此時正值白骨壤的盛果期，果實內(nèi)部的微生物得到充足的營養(yǎng)物質(zhì)從而大量生長繁殖，可能是果實和花中的內(nèi)生菌數(shù)量多于根、皮等部位的原因之一。此外，成熟期時果實的水分逐步流失、淀粉大量積累，使得該部位產(chǎn)生的內(nèi)生菌通常能耐受高滲透壓，具有淀粉酶活性[32]；在11種分離培養(yǎng)基中，AGG培養(yǎng)基最具優(yōu)勢，共分離到8個菌屬且多為放線菌，可作為分離內(nèi)生細(xì)菌的首選培養(yǎng)基，與李菲等[19]的研究結(jié)論一致。

在本研究的抑菌試驗中，36株細(xì)菌均至少對1種指示菌株具有抑制活性，其中有4株菌表現(xiàn)出廣譜抑菌活性，說明從白骨壤內(nèi)生細(xì)菌中分離出活性突出的次級代謝產(chǎn)物潛力巨大。其中，YA304和YA350的抑菌能力最突出，二者分別與BacillussiamensisKCTC13613T和MicromonosporawenchangensisCCTCCAA2012002T的相似性最高。Jeong等[33]發(fā)現(xiàn)暹羅芽孢桿菌KCTC13613T能顯著抑制植物病原真菌立枯絲核菌和灰葡萄孢菌，且對革蘭氏陽性菌黃體微球菌也有較強(qiáng)的抗菌活性。本研究分離到的暹羅芽孢桿菌YA304對大腸桿菌具有強(qiáng)抑制效果，對啤酒酵母、擴(kuò)展青霉菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉則有中等抑菌效果，進(jìn)一步豐富了對Bacillussiamensis菌株抑菌活性的認(rèn)識；文昌小單胞菌YA350對擴(kuò)展青霉的抑菌圈直徑達(dá)30.2 mm，活性最高，具有開發(fā)為天然殺菌劑和成為水果采后青霉病生防菌株的巨大潛力。Takahashi和Omura[34]研究指出，新物種中出現(xiàn)新型活性化合物的潛力相對較大，本研究8株潛在新種均至少對3種指示菌表現(xiàn)出抑制效果，與Takahashi和Omura[34]的研究結(jié)果吻合。

4 結(jié) 論

從白骨壤的果實、花、皮、根和葉部位分離得到的內(nèi)生細(xì)菌多樣性較豐富，潛在新種率較高，且部分菌株具有廣譜抑菌活性，可作為開發(fā)新型生物活性化合物的重要來源。