微生物菌劑對(duì)植煙土壤酚酸含量和微生物數(shù)量的調(diào)節(jié)作用

鐘 宇，曹敬東，鄭元仙，王繼明，許銀蓮，童文杰，藺忠龍，楊 敏，魏 薇，黃飛燕，劉佳妮，閆 鼎，蔡憲杰，陳小龍，余 磊*，何元?jiǎng)?

(1. 昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214；2.云南省煙草公司臨滄市公司，云南 臨滄 677000；3.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650201；4.中國煙草總公司云南省公司，云南 昆明 650011；5.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海 200082；6.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司原料采購中心，河南 鄭州 450000)

【研究意義】土壤是農(nóng)作物生長(zhǎng)的重要介質(zhì)，維持土壤良好的微生態(tài)環(huán)境是保障作物群體生產(chǎn)力的重要前提。烤煙連作障礙是烤煙生產(chǎn)中的一大難題[1]，有必要開發(fā)植煙土壤調(diào)理及修復(fù)的有效方法，提高煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量。【前人研究進(jìn)展】連作會(huì)導(dǎo)致土壤自毒物質(zhì)積累[2]、營養(yǎng)物質(zhì)失衡[3]、微生物數(shù)量減少[4-5]等問題。土壤微生物能夠促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化，是維持土壤生態(tài)平衡的重要組成部分。研究表明，土壤中的酚酸類物質(zhì)與土壤微生物活性有著密切的關(guān)系[6]，能夠顯著影響土壤微生物數(shù)量和多樣性，從而影響土壤養(yǎng)分和植物的生長(zhǎng)發(fā)育。酚酸對(duì)土壤微環(huán)境的調(diào)控體現(xiàn)在：一方面，酚酸在不影響植株正常生長(zhǎng)的低濃度情況下就可以通過直接的自毒作用或間接的抑制或促進(jìn)作用影響微生物活性[7]，另一方面，不同微生物對(duì)酚酸的響應(yīng)不同，作物持續(xù)分泌某些促進(jìn)病原菌生長(zhǎng)的酚酸會(huì)改變土壤微生物結(jié)構(gòu)，如黃瓜根系分泌的香豆素對(duì)土傳病原菌生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用[8]，香草醛能夠影響黃瓜根際鐮刀菌群落結(jié)構(gòu)[9]，這也是連作作物土傳病害逐年嚴(yán)重的主要原因之一。 微生物菌劑是現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)制備而成的活菌制劑，具有增加土壤肥力、改善土壤微生物結(jié)構(gòu)的作用[10]。Yang等報(bào)道微生物菌劑能夠改變煙草根際土壤微生物功能多樣性，從而改善植煙土壤微環(huán)境，減輕土傳病害[11]。譚兆贊等施用復(fù)合微生物菌劑提高了土壤微生物多樣性指數(shù)，有效緩解了番茄青枯病[12]。施用微生物菌劑能增加根際土壤有益細(xì)菌和真菌，減少土傳病原菌，從而有效減輕蘆蒿、黃瓜等作物土傳病害[13-14]。王佳佳等研究微生物菌劑對(duì)土壤化感物質(zhì)的響應(yīng)，結(jié)果表明，微生物菌劑能夠顯著降低土壤酚酸積累量，改善土壤理化性質(zhì)[15]。【本研究切入點(diǎn)】近年來對(duì)微生物菌劑的研究多集中于改善土壤理化性質(zhì)或改善土壤微生物多樣性方面，微生物菌劑對(duì)植煙土壤的修復(fù)作用，以及在微生物菌劑處理下土壤酚酸類物質(zhì)與微生物數(shù)量的變化及二者的相關(guān)性鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】針對(duì)植煙土壤微生態(tài)失衡、土傳病害嚴(yán)重問題，研究不同微生物菌劑對(duì)土壤酚酸含量和微生物數(shù)量的調(diào)節(jié)作用，為利用微生物菌劑修復(fù)連作障礙植煙土壤提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為“云煙87”。供試微生物菌劑為雙藻菌露200微生物菌劑，由青島海大生物集團(tuán)有限公司提供，其功能菌為地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌 (B.subtilis) 和巨大芽孢桿菌 (B.megateriu)，有效活菌數(shù)≥200.0億/g。農(nóng)用微生物菌劑，由山東領(lǐng)拓農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，其功能菌為解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌，有效活菌數(shù)≥30.0億/mL?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌 (B.licheniformis) 復(fù)合粉劑，由云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心提供，有效活菌數(shù)≥5.0億/g。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于云南省臨滄市耿馬縣勐撒鎮(zhèn) (99°23′22′′E, 23°33′ 40′′N)，海拔1120 m，土壤類型為紅壤，質(zhì)地為輕粘土。試驗(yàn)地土壤pH值為4.69，有機(jī)質(zhì)含量為29.13 g/kg，水解性氮含量為155.28 mg/kg，有效磷含量為8.84 mg/kg，速效鉀含量為145.97 mg/kg。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，1個(gè)對(duì)照。處理T1，施用雙藻菌露200微生物菌劑6 kg/hm2；處理T2，施用農(nóng)用微生物菌劑75 L/hm2；處理T3，施用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌復(fù)合粉劑300 kg/hm2；處理4 (CK)，空白對(duì)照，同期等量清水灌根。微生物菌劑于作物全生育期內(nèi)施用1次，用量為400 mL/株，作物移栽當(dāng)天邊灌根邊移栽，區(qū)組排列隨機(jī)，每小區(qū)種植30株，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 土壤樣品采集 于打頂7 d后，利用5點(diǎn)取樣法采取每個(gè)處理煙株根際土壤2 kg，立即置于4 ℃保存，用于酚酸含量和土壤微生物的測(cè)定。

1.4.2 根際土壤酚酸類物質(zhì)測(cè)定 土壤酚酸類物質(zhì)的測(cè)定采用高效液相色譜法進(jìn)行。稱取20 g供試土樣加入100 mL NaOH (2 mol/L)震蕩提取3 h，于4 ℃靜置3 h，上清液用乙酸乙酯萃取后45 ℃蒸干，加入5 mL 色譜純甲醇，過0.22 μm濾膜。濾液用外標(biāo)法測(cè)定酚酸類化合物，混和標(biāo)準(zhǔn)樣品為0.1 μg/mL對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸和阿魏酸。

色譜儀為WATERS2695高效液相色譜儀 (美國WATERS公司)，色譜柱為Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm, 美國WATERS公司)，流動(dòng)相A、B分別為0.3 %乙酸水溶液和甲醇，流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μl。洗脫程序：0 min：95 %流動(dòng)相A，5 %流動(dòng)相B；1 min：80 %流動(dòng)相A，20 %流動(dòng)相B；5 min：70 %流動(dòng)相A，30 %流動(dòng)相B；7.5 min：20 %流動(dòng)相A，80 %流動(dòng)相B；10 min：95 %流動(dòng)相A，5 %流動(dòng)相B。

1.4.3 土壤微生物數(shù)量測(cè)定 根際土壤細(xì)菌、真菌和放線菌種群數(shù)量測(cè)定采用稀釋平板計(jì)數(shù)法，細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 (牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、水 1000 mL、pH 7.0)，真菌培養(yǎng)采用孟加拉紅培養(yǎng)基 (葡萄糖1 g、蛋白胨0.5 g、KH2PO4·3H2O 1 g、MgSO4·7H2O 0. 5 g、1 mg/mL孟加拉紅3.3 mL、瓊脂 15 g、水 1000 mL)，放線菌培養(yǎng)采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基 (可溶性淀粉20 g、NaCl 0.5 g、KNO31 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂 15 g、水 1000 mL、pH 7.4～7.6)。微生物數(shù)量以每克樣品的菌數(shù)表示，每克樣品中菌數(shù)=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.4.4 煙株農(nóng)藝性狀和生物量測(cè)定 于打頂后7 d，測(cè)定各處理組代表性煙株農(nóng)藝性狀指標(biāo)及煙株地上部 (莖、葉)、地下部 (根) 鮮重和干重，每個(gè)處理3株。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌劑對(duì)根際土壤酚酸類物質(zhì)含量的影響

圖1表明，微生物菌劑的施用能夠顯著降低對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸5種酚酸類物質(zhì)在根際土壤中的積累。處理T1較處理T4 (CK)分別降低了59.76 %、19.16 %、59.30 %、66.08 %和74.83 %；處理T2較處理T4 (CK)分別降低了57.00 %、65.00 %、51.00 %、53.00 %和65.00 %；處理T3較處理T4 (CK)分別降低了21.25 %、24.04 %、15.12 %、32.94 %、45.03 %。處理T1和處理T2對(duì)阿魏酸的降低效果最為顯著，降幅分別為74.83 %和65.00 %。從總體看，處理T2對(duì)各類酚酸含量的降低效果最好，降幅達(dá)51.00 %～65.00 %。

圖1 不同處理根際土壤酚酸類物質(zhì)含量Fig.1 Soil phenolic acid contents with different treatments

2.2 微生物菌劑對(duì)根際土壤微生物數(shù)量的影響

利用平板稀釋分離計(jì)數(shù)法測(cè)定根際土壤微生物群落組成和數(shù)量。從表1可見，微生物菌劑處理下細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量均比對(duì)照組多。其中，處理T1的根際土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量分別為處理T4 (CK)的175.59 %、208.70 %和258.06 %；處理T2的根際土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量分別為處理T4 (CK)的178.19 %、213.04 %和322.58 %；處理T3的根際土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量分別為處理T4 (CK)的144.02 %、228.26 %和256.45 %，不同菌劑之間各類群微生物數(shù)量差異不明顯。

2.3 根際土壤微生物數(shù)量與酚酸類物質(zhì)含量的相關(guān)性

根際土壤微生物數(shù)量與酚酸類物質(zhì)含量顯示不同程度的負(fù)相關(guān)性 (表2)，其中，細(xì)菌數(shù)量與對(duì)羥基苯甲酸、4-香豆酸和阿魏酸呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，放線菌數(shù)量與香草酸呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

2.4 微生物菌劑對(duì)烤煙主要農(nóng)藝性狀和生物量的影響

由表3可見，微生物菌劑處理下煙株的株高、有效葉片數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、莖粗及生物量等均高于對(duì)照組，其中以生物量的影響最為顯著，處理T1、處理T2和處理T3單株干重分別為處理T4 (CK)的124.15 %、111.62 %和126.99 %，說明微生物菌劑對(duì)烤煙的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。

3 討 論

酚酸類物質(zhì)可通過植物自身根系分秘、微生物腐解、淋溶等多種途徑進(jìn)入土壤，并影響土壤微生物結(jié)構(gòu)與活性。研究表明，土壤中的酚酸物質(zhì)既能抑制有益微生物的生長(zhǎng)，也能為病原菌生長(zhǎng)提供營養(yǎng)，從而改變土壤微生態(tài)平衡，這是連作作物土傳病害逐年嚴(yán)重的原因之一[16-17]。微生物菌劑是利用有益微生物菌群經(jīng)特殊工藝制成的活菌制劑，施用微生物菌劑能調(diào)節(jié)土壤酚酸含量，促進(jìn)作物生長(zhǎng)[18-20]。研究結(jié)果表明，施用微生物菌劑能顯著降低對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸和阿魏酸等5種酚酸類物質(zhì)在土壤中的積累，并可促進(jìn)煙株生長(zhǎng)，施用雙藻菌露200微生物菌劑6 kg/hm2(處理T1)、施用農(nóng)用微生物菌劑75 L/hm2(處理T2)、施用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌復(fù)合粉劑300 kg/hm2(處理T3)的煙株干物質(zhì)積累量分別為清水對(duì)照的124.15 %、111.62 %和126.99 %，前人的研究也有類似結(jié)果。

表1 不同處理根際土壤微生物數(shù)量

表2 根際土壤微生物數(shù)量和酚酸含量的相關(guān)性分析

表3 不同處理對(duì)烤煙農(nóng)藝性狀和生物量

土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的結(jié)構(gòu)和數(shù)量影響土壤的微生態(tài)平衡。施用微生物菌劑能夠加快有益微生物在土壤中的繁殖，改善土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)[21-22]。土壤微生物數(shù)量測(cè)定結(jié)果表明，微生物菌劑處理后，煙株根際土壤中三類微生物的數(shù)量均顯著高于對(duì)照組，與高峰等[23]的研究有類似結(jié)果。

土壤中的酚酸類物質(zhì)與土壤微生物關(guān)系密切，酚酸類物質(zhì)能夠影響土壤微生物數(shù)量和多樣性，微生物群落和數(shù)量的改變也會(huì)影響土壤理化特征的變化[6]，白羽祥、張玥琦等報(bào)道酚酸類物質(zhì)含量與細(xì)菌豐度顯著相關(guān)[17, 24]，呈現(xiàn)出根系分泌的化感物質(zhì)能夠抑制某些病原微生物的生長(zhǎng)[9]，土壤微生物能夠促進(jìn)酚酸類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與分解[25-26]，根系微生物數(shù)量與種群的增加能加快這一進(jìn)程，降低酚酸物質(zhì)的化感活性。通過對(duì)土壤根際微生物數(shù)量與酚酸物質(zhì)含量的相關(guān)性的研究，結(jié)果表明細(xì)菌數(shù)量與對(duì)羥基苯甲酸、4-香豆酸和阿魏酸呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，放線菌數(shù)量與香草酸呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，微生物菌劑的施用有效增加了土壤微生物的數(shù)量，從而降低土壤酚酸物質(zhì)含量，白羽祥[17]等的研究也有類似結(jié)果。

4 結(jié) 論

土壤微生物數(shù)量與酚酸物質(zhì)含量存在密切的相互影響關(guān)系，施用微生物菌劑能夠有效提高土壤微生物豐度，降低根際土壤酚酸類物質(zhì)含量，對(duì)根系土壤微生態(tài)環(huán)境起到了較好的調(diào)節(jié)作用，有效促進(jìn)煙葉生長(zhǎng)。