白藜蘆醇通過介導(dǎo)內(nèi)臟脂肪NPY表達改善限食后重飼大鼠胰島素敏感性

王素星,李會英,呂彩霞,邵偉華,李秀芩,姚麗霞(河北省人民醫(yī)院老年病二科,石家莊 05005;河北省人民醫(yī)院超聲科;通信作者,E-mail:83383@qq.com)

人體的各種生理活動都離不開能量的支持,能量供應(yīng)產(chǎn)生波動,可影響人體的各種生理活動,導(dǎo)致機體代謝發(fā)生一系列改變[1]。限食后的重飼為短期熱卡限制后重新開放飲食,可導(dǎo)致能量攝入的波動。不適當(dāng)限食減肥后飲食反彈、疾病和疾病的康復(fù)等均伴隨熱卡攝取的波動[2]。有研究顯示,成年期追趕生長以胰島素抵抗和內(nèi)臟脂肪堆積為重要特征[3],追趕生長即較短期內(nèi)能量攝入的波動,可導(dǎo)致胰島素敏感性的降低和內(nèi)臟脂肪增多。內(nèi)臟脂肪細胞既是能量儲存器官,又具有強大的內(nèi)分泌功能[4]。它可產(chǎn)生大量脂肪細胞因子、激素、炎癥介質(zhì)等直接進入肝臟及全身組織,在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平誘導(dǎo)胰島素抵抗[5]。神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)是食欲刺激因子,與能量波動密切相關(guān)[6]。多項研究表明,NPY過表達可以造成大鼠內(nèi)臟脂肪增多的肥胖表型,而低表達則促進能量代謝,有助于減輕體質(zhì)量,促使白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)化,阻止代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。

白藜蘆醇是一種主要存在于虎杖、葡萄、藜蘆、花生等植物中的多酚類化合物。以往的研究表明,白藜蘆醇可以抑制脂肪生成,刺激脂肪分解,增加脂肪酸氧化和熱生成[8]?？诜邹继J醇亦可以安全地減少小鼠過量熱量攝入導(dǎo)致的諸多負面后果,緩解與肥胖有關(guān)的外周和中樞炎癥和代謝紊亂,總體上改善健康和生存[9]。目前,白藜蘆醇對限食后重飼大鼠胰島素敏感性改善作用機制尚未明確。所以本研究以此為切入點,觀察白藜蘆醇對限食后重飼大鼠內(nèi)臟脂肪NPY表達的影響以及對胰島素敏感性的改善作用,以期為與白藜蘆醇的有關(guān)保健產(chǎn)品與食品的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

48只健康SPF級6周齡SD雄性大鼠,體質(zhì)量160-180 g,由河北醫(yī)科大學(xué)科研實驗動物飼養(yǎng)中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(冀)2018-004,飼料墊料生產(chǎn)許可證號SCXK(冀)2018-003。動物房溫度控制在20-25 ℃,濕度在50%-60%,自由飲水,光照時間12 h(7:00-19:00)。

1.2 主要試劑與儀器

Western blot一抗兔抗大鼠NPY抗體(英國,Abcam Company公司),二抗山羊抗兔IgG(重鏈+輕鏈,辣根過氧化物酶);DEXA儀由美國GE Lunar公司生產(chǎn)。TNF-α、IL-6、FFA、胰島素測定采用ELASA試劑盒(Pierce公司),微量輸注泵(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器有限公司),穩(wěn)步血糖儀(強生),重組人胰島素(諾和諾德),一次性留置針。

1.3 研究方法

48只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為6組,每組10只:正常飲食4周(NC4)組、熱卡限制4周(R4)組,熱卡限制白藜蘆醇干預(yù)(R4R)組;以及正常飲食12周(NC12)組、限食后重飼組(RN)、限食后重飼白藜蘆醇干預(yù)(RNR)組。分別在實驗第4和12周末進行相關(guān)指標(biāo)檢測,統(tǒng)計學(xué)分析僅限于相同時間點組別之間進行。其中,熱卡限制4周組和限食后重飼組給予正常飲食組相同體質(zhì)量大鼠進食量60%的標(biāo)準基礎(chǔ)飼料4周,限食后重飼組在接下來的8周給予正常飲食組相同體質(zhì)量大鼠等量的標(biāo)準基礎(chǔ)飼料和100 mg/(kg·d)白藜蘆醇干預(yù),熱卡限制白藜蘆醇干預(yù)組在熱卡限制同時亦給予白藜蘆醇[100 mg/(kg·d)]干預(yù)4周。普通飼料購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部。所有實驗程序均經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會批準。白藜蘆醇用生理鹽水配制成濃度15 mg/ml的懸濁液,根據(jù)體質(zhì)量每天灌胃給予白藜蘆醇(100 mg/kg)干預(yù),熱卡限制4周組和限食后重飼組灌胃給予以同體積生理鹽水。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 體脂成分檢測 大鼠禁食過夜,精確稱量體質(zhì)量,腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉,待大鼠肌力消失,呼吸平穩(wěn),仰臥位將四肢用膠帶固定于硬紙板,選用美國GE Lunar公司生產(chǎn)的DEXA儀行軀干脂肪含量及軀干與全身脂肪比例測定。

1.4.2 高胰島素-正糖鉗夾實驗第60-120分鐘的平均葡萄糖輸注速率(average glucose infusion rate during 60-120 min,GIR60-120)測定 大鼠限食過夜后,進行120 min清醒狀態(tài)下大鼠尾動靜脈插管高胰島素-正糖鉗夾試驗(以下簡稱正糖鉗夾),計算GIR60-120。糖鉗開始前尾靜脈留取空腹血。具體操作過程參閱課題組以前操作[10]。糖鉗結(jié)束后,以致死量戊巴比妥鈉(150 mg/kg)腹腔注射處死大鼠,迅速完整剝離腎周脂肪組織,一部分迅速10%甲醛固定用于形態(tài)學(xué)觀察,其余組織液氮罐凍存留作Western blot檢測。

1.4.3 空腹血糖、胰島素檢測 采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG),放免法測定空腹胰島素(fasting insulin,FINS)的濃度,遵照胰島素放免試劑盒說明書逐步進行。

1.4.4 腎周脂肪細胞形態(tài)學(xué)測定 腎周脂肪組織10%多聚甲醛固定,梯度酒精脫水,二甲苯透明石蠟包埋切片,厚8 μm。常規(guī)HE染色,封片后光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.5 Western blot測定NPY表達 選取腎周脂肪組織,參照既往文獻[11]方法提取并定量組織蛋白。取80 μg蛋白樣品行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,分別用NPY、β-actin 4 ℃孵育過夜;次日洗膜、二抗孵育1 h、采用BIO-RAD Image Lab軟件進行灰度值分析。

1.4.6 胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)測定 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)測定采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒,具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 軀干脂肪含量比較

熱卡限制4周后,R4組軀干脂肪含量及軀干與全身脂肪比例與NC4組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);重飼8周后,RN組軀干脂肪含量及軀干與全身脂肪比例與NC12組相比顯著升高(P<0.01)。白藜蘆醇干預(yù)后,R4R組軀干與全身脂肪比例較R4組顯著下降(P<0.05),RNR組軀干脂肪含量及軀干與全身脂肪比例較RN組均顯著下降(P<0.05),達到NC組水平,但R4R組軀干脂肪含量較R4組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表1,2)。

表1 白藜蘆醇干預(yù)前后4周組大鼠軀干脂肪含量和軀干與全身脂肪比例比較

表2 白藜蘆醇干預(yù)前后12周組大鼠軀干脂肪含量和軀干與全身脂肪比例比較

2.2 腎周脂肪細胞HE染色

與NC12組相比,RN組腎周脂肪細胞體積顯著增大,形狀不規(guī)則,胞膜破裂、融合。白藜蘆醇干預(yù)后,RNR組腎周脂肪細胞體積較RN組明顯變小,形狀規(guī)則、胞膜完整,接近NC12組(見圖1)。

圖1 白藜蘆醇干預(yù)前后12周組大鼠腎周脂肪細胞HE染色 (×400)Figure 1 HE staining of perirenal adipocytes in rats in 12-week groups before and after resveratrol intervention

2.3 胰島素敏感性檢測結(jié)果

與NC4組相比,R4組FPG、FINS、GIR60-120差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);開放飲食后,與NC12組相比,RN組FINS顯著升高,GIR60-120明顯下降(P<0.01),FPG變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。白藜蘆醇治療后,RNR組FINS水平較RN組顯著降低(P<0.01),但仍較NC12組高(P<0.05);R4R組FPG和FINS,RNR組FPG與未干預(yù)前相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);R4R組GIR60-120較R4組無明顯差異(P>0.05),RNR組GIR60-120明顯高于RN組(P<0.01),恢復(fù)至NC12組水平(P>0.05,見圖2-4)。

圖2 白藜蘆醇干預(yù)前后4周組和12周組大鼠空腹血糖比較Figure 2 Comparison of fasting plasma glucose of rats between 4-week groups and between 12-week groups before and after resveratrol intervention

與正常飲食4周組比較,△P<0.05;與正常飲食12周組比較,*P<0.05,**P<0.01;與限食后重飼組比較,##P<0.01圖3 白藜蘆醇干預(yù)前后4周組和12周組大鼠空腹胰島素比較Figure 3 Comparison of fasting insulin of rats between 4-week groups and between 12-week groups before and after resveratrol intervention

與正常飲食12周組比較,**P<0.01;與限食后重飼組比較,##P<0.01圖4 白藜蘆醇干預(yù)前后4周組和12周組大鼠第60-120 min平均葡萄糖輸注率比較Figure 4 Comparison of average glucose infusion rate during 60-120 min of rats between 4-week groups and between 12-week groups before and after resveratrol intervention

2.4 胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)比較

與NC4組相比,R4組熱卡限制使血清TNF-α、IL-6水平明顯降低(P<0.01),FFA水平升高(P<0.05)。重飼后,與NC12組相比,RN組血清TNF-α、IL-6及FFA水平均顯著升高(P<0.01)。白藜蘆醇干預(yù)后,與R4組相比,R4R組血清TNF-α、IL-6的濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義;FFA水平明顯下降(P<0.05);與RN組比較,RNR組血清TNF-α、IL-6及FFA的濃度均顯著下降(P<0.01),除RNR組血清IL-6水平降至NC12組水平(P>0.05),其他兩指標(biāo)仍較NC12組高(P<0.05,見圖5-7)。

與正常飲食4周組比較,▲▲P<0.01;與正常飲食12周組比較,*P<0.05,**P<0.01;與限食后重飼組比較,##P<0.01圖5 白藜蘆醇干預(yù)前后4周組和12周組大鼠腫瘤壞死因子α比較Figure 5 Comparison of tumor necrosis factor-α in rats between 4-week groups and between 12-week groups before and after resveratrol intervention

與正常飲食4周組比較,▲▲P<0.01;與正常飲食12周組比較,**P<0.01;與限食后重飼組比較,##P<0.01圖6 白藜蘆醇干預(yù)前后4周組和12周組大鼠白介素6比較Figure 6 Comparison of interleukin-6 in rats between 4-week groups and between 12-week groups before and after resveratrol intervention

與正常飲食4周組比較,△P<0.05;與熱卡限制4周組比較,▲P<0.05;與正常飲食12周組比較,*P<0.05,**P<0.01;與限食后重飼組比較,##P<0.01圖7 白藜蘆醇干預(yù)前后4周組和12周組游離脂肪酸比較Figure 7 Comparison of free fatty acid in rats between 4-week groups and between 12-week groups before and after resveratrol intervention

2.5 GIR60-120與胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

GIR60-120與FFA、FINS、IL-6及TNF-α均呈顯著負相關(guān)(r值分別為-0.701,-0.797,-0.695,-0.761,均P<0.01)。

2.6 Western blot結(jié)果

與NC4組相比,R4組熱卡限制使腎周脂肪組織NPY蛋白表達顯著增加(P<0.01);開放飲食8周后,RN組腎周脂肪組織NPY的蛋白表達輕度下降,但至實驗結(jié)束,仍顯著高于NC12組(P<0.01)。經(jīng)白藜蘆醇治療后,R4R組和RNR組腎周脂肪組織NPY表達分別較R4組和RN組顯著下降(P<0.01),其中RNR組恢復(fù)至NC12組水平(P>0.05),R4R組仍較NC4組為高(P<0.01,見圖8)。

與正常飲食4周組比較,▲▲P<0.01;與熱卡限制4周組比較,##P<0.01;與正常飲食12周組比較,**P<0.01;與限食后重飼組比較,△△P<0.01圖8 白藜蘆醇干預(yù)前后4周組和12周組大鼠腎周脂肪組織NPY蛋白表達的比較Figure 8 Comparison of NPY protein expression in perirenal adipose tissue of rats between 4-week groups and between 12-week groups before and after resveratrol intervention

3 討論

NPY是明顯的食欲刺激因子,其表達受能量攝入影響[6]。它不僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,也存在于外周脂肪組織、骨骼、血管、腎臟等組織,參與調(diào)節(jié)機體多種重要的生理活動,對脂肪代謝亦有重要調(diào)節(jié)作用[12]。NPY作為外周脂肪增殖和分化相關(guān)細胞、外周脂肪細胞的生物效應(yīng)分子,通過與其受體結(jié)合,在肥胖的形成中發(fā)揮重要作用[13]。本研究結(jié)果顯示,腎周脂肪組織NPY的表達在熱卡限制期間明顯增加,恢復(fù)飲食后,雖有輕度下降,但至實驗結(jié)束,其表達水平仍較正常對照組增加明顯。有研究發(fā)現(xiàn)局部脂肪組織NPY表達增多,可促進新生脂肪形成[14]。該研究將包有NPY的緩釋藥片植入到鼠的皮下組織中,發(fā)現(xiàn)在藥片植入的周圍有新的脂肪生成[14]。故限食后重飼過程中,NPY在腎周脂肪組織的持續(xù)高表達,雖在限食階段因沒有充足營養(yǎng)供給使這種促進脂質(zhì)生成的能力無法實現(xiàn),但恢復(fù)飲食后促進脂肪生成增多,導(dǎo)致軀干部脂質(zhì)含量及比例均顯著增加,同時亦使脂肪細胞的體積越來越大,胞膜破裂,脂質(zhì)外溢,炎癥因子釋放顯著增多。正糖鉗夾試驗中葡萄糖輸注率是評價胰島素敏感性的重要指標(biāo),本研究結(jié)果亦顯示,能量攝入改變過程中RN組出現(xiàn)GIR60-120下降、胰島素水平升高,同時伴FFA、TNF-α、IL-6水平增加的胰島素抵抗現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示GIR60-120與FFA、TNF-α、IL-6水平呈顯著負相關(guān)。炎癥因子的激活使胰島β細胞的結(jié)構(gòu)和功能受到損傷、外周組織對胰島素的敏感性降低[15],同時高水平FFA通過降低靶細胞膜上胰島素受體的數(shù)目及其與胰島素的親和力,抑制胰島素與受體的結(jié)合,降低胰島素的生物效應(yīng)[16]。以上因素均可導(dǎo)致胰島素抵抗的形成。

NPY與脂肪代謝密切相關(guān),RN組高表達的NPY使軀干脂肪含量增加,而內(nèi)臟脂肪的增多與胰島素敏感性關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示,限食后重飼動物胰島素敏感性的下降可能與內(nèi)臟脂肪堆積有關(guān)。白藜蘆醇治療后,RNR組腎周脂肪的NPY表達大幅降低,與之伴行的,RNR組軀干部脂質(zhì)含量及比例均顯著降低,腎周脂肪細胞形態(tài)及胞膜完整性明顯改善,FFA及炎癥因子濃度亦明顯降低,GIR60-120恢復(fù)至正常水平,胰島素敏感性顯著提高。故白藜蘆醇通過降低內(nèi)臟脂肪的NPY表達,減少內(nèi)臟脂肪生成,改善胰島素抵抗,增強機體胰島素敏感性。關(guān)于白藜蘆醇對NPY的影響,研究目前主要集中在白藜蘆醇對下丘腦NPY的影響。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可使高脂飲食的小鼠下丘腦弓狀核NPY生成減少,進而影響脂肪生成,降低體質(zhì)量[17]。白藜蘆醇亦能夠通過過度表達厭食肽(前阿片蛋白)和/或抑制食欲肽(神經(jīng)肽Y/刺鼠相關(guān)肽)來恢復(fù)神經(jīng)元中的瘦素信號,從而減少食物攝入[18]。白藜蘆醇是沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silencing information regulator 1,SIRT1)的強力激活劑,有研究顯示NPY的缺失可激活SIRT1信號傳導(dǎo)[19]。亦有研究顯示,外源注射煙酰胺腺嘌呤二核苷酸可抑制NPY的轉(zhuǎn)錄活性,這種抑制作用部分是由SIRT1介導(dǎo)的[20]。以上研究可得出SIRT1與NPY的表達存在負性調(diào)控作用,故推測白藜蘆醇亦可通過激活SIRT1,后者進一步抑制內(nèi)臟脂肪NPY的表達,進而發(fā)揮抑制脂質(zhì)合成的作用。

需要注意的是,白藜蘆醇并不是在所有組均表現(xiàn)出了增加GIR60-120的效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)R4R組大鼠的GIR60-120不升高反而輕度降低。相對于RNR組白藜蘆醇可顯著增加實驗?zāi)Ｐ虶IR60-120的結(jié)果,我們分析R4組實驗大鼠在熱卡限制期末,GIR60-120輕度升高,空腹血糖、胰島素水平輕度下降,雖較NC4組無統(tǒng)計學(xué)差異,但綜合評估胰島素的敏感性已呈輕度增高現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上,即使白藜蘆醇可抑制內(nèi)臟脂肪NPY的表達,但對內(nèi)臟脂肪含量本就不高、胰島素敏感性已經(jīng)很好的R4組大鼠,要想使胰島素敏感性得到進一步提升,白藜蘆醇的生物學(xué)效應(yīng)就微乎其微。其中涉及的其他信號通路作用機制需進一步研究。

綜上所述,白藜蘆醇可能通過抑制以腎周脂肪為代表的內(nèi)臟脂肪NPY表達進而減少軀干部脂肪堆積,減少內(nèi)臟脂肪脂質(zhì)外溢、炎癥因子釋放,最終改善限食后重飼大鼠胰島素敏感性。