DJ-1調(diào)控AMPK/mTOR信號在恢復糖尿病心肌對缺血后處理敏感性中的作用

周 斌,余艷麗,邱 珍,孟慶濤,夏中元(武漢大學人民醫(yī)院麻醉科,武漢 430060;通信作者,E-mail:xia-zhongyuan2005@aliyun.com)

循證醫(yī)學研究表明,糖尿病患者更易發(fā)生急性心肌梗死,即便恢復冠脈血流,其發(fā)生缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)的程度更重,預后更差,死亡率更高[1]。缺血后處理(ischemia post-conditioning,IPO)被證實為抵抗心肌IRI行之有效的方案[2-4],然而,既往研究顯示糖尿病患者心肌對IPO的保護作用失敏感[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者心肌中DJ-1蛋白表達顯著下降[5],進而導致心肌細胞自噬水平下降[6],這可能是糖尿病患者心肌IRI易損性增加且對IPO保護作用失敏感的重要原因,但其具體調(diào)控機制尚未闡明。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在自噬的調(diào)控中發(fā)揮了重要的作用[7],此外,亦有研究表明DJ-1對AMPK具有調(diào)控作用[8]。因此,我們推測,DJ-1可能通過調(diào)控AMPK/mTOR信號通路介導自噬活性。本實驗以糖尿病大鼠為研究對象,通過建立急性心肌IRI模型,探討過表達DJ-1是否能恢復糖尿病心肌對IPO的敏感性,并試圖闡明AMPK/mTOR信號及其下游自噬在此過程中扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設備

鏈脲佐菌素、戊巴比妥鈉、伊文思藍和氯化苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC),AMPK抑制劑復合物C均購于美國Sigma公司,肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)ELISA試劑盒購于南京建成生物工程研究所,AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購于美國CST公司,熒光二抗購于美國Millpore公司。ALCV9型動物呼吸機購于上海奧爾科特公司,Odyssey紅外掃描顯影儀購于美國Li-Cor公司。

1.2 糖尿病模型制備

8周齡雄性SD大鼠,體質(zhì)量210-250 g,購自湖南斯萊克景達有限公司,生產(chǎn)許可證號SCXK(京):2016-2019,批號:43004700023411。適應性飼養(yǎng)3 d,禁食12 h,參照文獻[3]采用單次腹腔注射1%鏈脲佐菌素-檸檬酸鹽緩沖液(Sigma公司,美國)60 mg/kg的方法制備1型糖尿病模型。造模72 h斷尾取血測定血糖,以空腹血糖濃度≥16.7 mmol/L,并出現(xiàn)多飲、多食、多尿和消瘦等癥狀為1型糖尿病模型制備成功。

1.3 動物分組

取制備成功的糖尿病模型大鼠60只,隨機分為5組(n=12):缺血再灌注組(IR)、缺血后處理組(IPO)、心肌DJ-1過表達+缺血再灌注組(DIR)、心肌DJ-1過表達+缺血后處理組(DIPO),心肌DJ-1過表達+缺血后處理+AMPK通路抑制劑復合物C(DIPOC)。

1.4 重組腺相關病毒(rAAV)及復合物C的注射

DIR組和DIPO組糖尿病大鼠飼養(yǎng)5周時,參照文獻[9]將攜帶DJ-1基因的心肌親和腺相關病毒9型(rAAV9-CMV-DJ-1,漢恒生物)按2×1012vg/kg的劑量經(jīng)尾靜脈注射,3周后,腺相關病毒將達到表達高峰。DIPOC組大鼠于缺血前30 min尾靜脈注射AMPK抑制劑復合物C 5 mg/kg。

1.5 缺血再灌注及缺血后處理模型的建立

糖尿病大鼠病程8周。腹腔注射0.9%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后固定妥當，置皮下電極監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖。行氣管切開術，動物呼吸機機械通氣。IR組和DIR組于左鎖骨中線處切開胸壁，分離冠狀動脈左前降支(LAD)并穿線，穩(wěn)定10 min，采用結(jié)扎LAD 30 min，再松開120 min的方法建立心肌IR模型；IPO組和DIPO組于再灌注前行3個循環(huán)的再灌注10 s/缺血10 s。

1.6 血清CK-MB含量檢測

再灌注2 h時，心尖取血，4 ℃離心后取上清液，采用檢測試劑盒檢測血清CK-MB的水平。

1.7 心肌梗死面積的檢測

每組隨機選擇6只大鼠，原位結(jié)扎LAD，經(jīng)股靜脈注射0.3%的伊文思藍將心肌藍染后，立即取心-20 ℃冷凍1 h，沿垂直于心臟長軸的方向?qū)⑵淝袨? mm的薄片，置于1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑磷酸鹽緩沖液中，37 ℃避光孵育20 min，中性甲醛固定20 min后掃描。采用Image-ProPlus 6.0軟件測定心梗面積，白色區(qū)域為梗死區(qū)，磚紅色區(qū)域為缺血危險區(qū)，以梗死區(qū)/缺血危險區(qū)面積的百分比表示心肌梗死范圍(%)。

1.8 心肌DJ-1蛋白含量、AMPK/m TOR信號通路活性及自噬水平的檢測

各組取6只大鼠心臟，進行常規(guī)的蛋白抽提、定量和變性，行SDS-PAGE電泳，蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，于兔抗鼠DJ-1、p-AMPK、p-mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和GAPDH抗體(稀釋度1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，于羊抗兔熒光二抗(稀釋度1 ∶15 000)室溫孵育1 h；使用Odyssey紅外掃描顯影儀掃描并分析測定灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比例表示目的蛋白表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 心梗面積與血清CK-MB水平

與IR組比較,IPO組心梗面積[(52.57±5.00)%vs(50.38±6.14)%]和血清CK-MB水平[(1 683.02±258.12)U/Lvs(1 574.12±264.19)U/L]變化無統(tǒng)計學差異(均P>0.05),而DIPO組心梗面積[(32.92±6.09)%]和CK-MB水平[(879.60±195.70)U/L]顯著下降(均P<0.05)。IR組與DIR組間比較,上述指標差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05,見圖1)。

與IR組比較,*P<0.05圖1 各組再灌注后心梗面積和血清CK-MB含量比較 (n=6)Figure 1 Comparison of myocardial infarct size and serum CK-MB release among five groups (n=6)

2.2 心肌DJ-1表達,AMPK/mTOR信號及LC3Ⅱ/Ⅰ比值

IR組與IPO組之間比較,心肌DJ-1(1.00±0.00vs1.08±0.19)、p-AMPK(1.00±0.00vs1.08±0.19)、p-mTOR水平(1.00±0.00vs0.96±0.14)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值(1.00±0.00vs0.98±0.17)差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。腺相關病毒轉(zhuǎn)染過表達DJ-1后,心肌DJ-1含量增加約3倍。與IR組比較,DIPO組心肌DJ-1(3.17±0.36),p-AMPK表達(2.19±0.37)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值(1.26±0.20)顯著增加,p-mTOR(0.56±0.10)顯著下降(均P<0.05);IR組與DIR組比較,上述指標差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05,見圖2-5)。

與IR組比較,*P<0.05圖2 各組心肌DJ-1表達情況 (n=6)Figure 2 Comparison of DJ-1 in myocardium among all five groups (n=6)

與IR組比較,*P<0.05;與DIPO組比較,#P<0.05圖3 各組心肌p-AMPK表達情況 (n=6)Figure 3 Comparison of p-AMPK expression in myocardium among five groups (n=6)

與IR組比較,*P<0.05;與DIPO組比較,#P<0.05圖4 各組心肌p-mTOR表達情況 (n=6)Figure 4 Comparison of p-mTOR expression in myocardium among five groups (n=6)

3 討論

本研究參照文獻[10]的方法建立1型糖尿病大鼠模型和心肌缺血再灌注模型,結(jié)果顯示糖尿病大鼠血糖均高于16.7 mmol/L,且出現(xiàn)多食、多飲、多尿、體型消瘦等典型的糖尿病癥狀;大鼠心肌IRI后,其心梗面積和血清CK-MB水平顯著增加,提示急性心梗模型建立成功。既往研究證實IPO能有效減輕非糖尿病大鼠的心肌IRI[2,3],然而本實驗的結(jié)果提示,糖尿病心肌對IPO的保護作用失敏感,這與前期的研究結(jié)果相一致[3]。

與IR組比較,*P<0.05;與DIPO組比較,#P<0.05圖5 各組心肌LC3Ⅱ/Ⅰ比值 (n=6)Figure 5 Comparison of LC3Ⅱ/Ⅰ ratio in myocardium among five groups (n=6)

DJ-1是一種高表達于心肌的多功能蛋白,對維持心臟的正常生理活動具備重要意義[11]。前期研究證實,糖尿病心肌中DJ-1表達下調(diào),并抑制其下游PTEN/PI3K/eNOS通路,這可能是糖尿病心肌氧化應激加重、IRI易損性增加且對IPO失敏感的重要原因[2],但具體調(diào)控機制仍未明確。此外,一項在H9c2細胞株上的研究發(fā)現(xiàn),在高糖環(huán)境下,H9c2細胞的缺氧復氧損傷顯著增加,且對缺氧后處理的保護作用失敏感,進一步探究發(fā)現(xiàn),這與H9c2細胞中DJ-1低表達,繼而細胞自噬抑制密切相關;而過表達DJ-1能顯著提高細胞自噬,恢復缺氧后處理對H9c2細胞的保護作用。然而此過程中,DJ-1是通過何種機制調(diào)控自噬的尚未明確。

AMPK是一種高度保守的蛋白激酶,在調(diào)控機體能量代謝和對抗有害刺激等方面扮演了十分重要的角色[12]。研究證實AMPK調(diào)控的mTOR通路在自噬的調(diào)控中發(fā)揮了十分重要的作用。Guo等[13]的研究證實糖尿病心肌AMPK磷酸化水平顯著下調(diào),心肌自噬水平降低,這可能是糖尿病心肌病的重要機制。此外,亦有研究證實AMPK/mTOR調(diào)控的自噬在心肌缺血再灌注方面具有重要意義[14],值得關注的是,DJ-1被證實為AMPK的上游調(diào)控因子,尤其是在缺氧環(huán)境下[15]。在體敲除DJ-1后,AMPK/mTOR通路失活,其下游的自噬水平降低,從而加重高糖刺激引起的細胞凋亡和損傷[8]。基于此,我們推測,在糖尿病心肌中,DJ-1低表達降低AMPK/mTOR通路活性,繼而抑制細胞自噬是糖尿病心肌對IPO的保護作用失敏感的重要原因。

在本研究中,我們利用基因干預技術,通過對糖尿病大鼠注射攜帶DJ-1基因的AAV9,實現(xiàn)糖尿病心肌DJ-1蛋白的過表達。AAV9介導的基因干預在心肌病的防治方面取得了良好的研究結(jié)果,具備廣泛的研究前景[16]。AAV在注射后第3周達表達峰值,因本研究選取糖尿病病程8周的大鼠作為研究對象,故我們在糖尿病模型誘導成功后的第5周進行AAV注射,待其病程至第8周時,AAV表達已進入表達高峰。我們前期研究證實，AAV注射組糖尿病大鼠心肌DJ-1蛋白表達為非注射組對照組的3倍，證實AAV9介導的DJ-1過表達成功,并且DJ-1過表達能有效恢復糖尿病心肌對IPO的敏感性,在此過程中,p-AMPK水平增加、p-mTOR水平下降,說明AMPK/mTOR通路顯著激活,且自噬相關蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比例明顯上調(diào),說明自噬水平增加。進一步研究發(fā)現(xiàn),復合應用AMPK抑制劑復合物C可顯著抑制AMPK/mTOR信號活性,抑制細胞自噬,逆轉(zhuǎn)DJ-1過表達聯(lián)合IPO對糖尿病IRI心肌的保護作用,這強烈提示,心肌過表達DJ-1通過激活AMPK/mTOR通路上調(diào)細胞自噬水平,從而恢復糖尿病心肌對IPO的敏感性。

綜上所述,糖尿病狀態(tài)下,DJ-1下調(diào)導致的自噬抑制是糖尿病心肌對IPO失敏感的重要原因,心肌過表達DJ-1可恢復其對IPO的敏感性,其機制可能與激活AMPK/mTOR信號通路,進而上調(diào)細胞自噬水平有關。