基于不同提取方法的月季香氣成分比較分析

孫海楠 呂運舟 汪有良

關鍵詞：月季;香氣;蒸餾法;溶劑法;固相微萃取法

中圖分類號：S685.12文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）05-1342-03

現(xiàn)代月季（Rosa hybrida）是傳統(tǒng)月季與薔薇屬其他植物通過人工雜交所獲得的復雜類群，廣泛應用于園林綠化和家庭園藝中[1]。藤本月季的抗逆性強，且生長旺盛，是公園、庭院垂直綠化的優(yōu)選植物[2]。花卉的香氣不僅可以使人身心愉悅，其中一些成分還對人體健康具有積極作用[3]，培育出花朵具有芳香氣味的品種是觀賞植物重要的育種目標[4-6]。花朵的香氣成分非常復雜，且多為相對分子質(zhì)量較小的易揮發(fā)物質(zhì)，因此在對花朵香氣成分進行研究時，香氣組分的收集和提取方法尤為重要，不同的提取方法對最終檢測結果有很大影響[4]。目前，實驗室提取植物揮發(fā)物的傳統(tǒng)方法主要為蒸餾法和溶劑法[7]。固相微萃?。⊿PME）法是一種新型的揮發(fā)物收集方法，屬于高分子材料吸附法[8]。

大花藤本月季香粉蝶的開花量大，并且香氣濃郁，具備良好的應用前景，不僅可以直接用于園林造景中，還可以作為后續(xù)培育芳香型月季品種的育種材料[9-10]。本研究擬通過比較蒸餾法、溶劑法、SPME法對香粉蝶花朵香氣組分的提取效果，并對提取的香氣組分進行氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）分析，確定芳香氣味的主要成分及其相對含量，篩選適合月季香氣組分研究的樣品前處理方法，以期為芳香型品種的選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料大花藤本月季香粉蝶取自江蘇省林業(yè)科學研究院月季種質(zhì)資源圃內(nèi)，選取處于盛花期的新鮮花瓣，用去離子水將花瓣洗凈后再用吸水紙吸去表面水分，自然陰干備用。

1.2蒸餾法

準確稱取50 g香粉蝶花瓣，加入100 μl正十二烷，置于2 000 ml燒瓶中蒸餾提取3 h，隨后將餾出物用10 ml乙醚萃取1 h，靜置分液后加入無水硫酸鈉充分渦旋干燥，過濾獲得純凈的乙醚萃取液。重復上述操作4次，并將獲得的萃取液混合，于36.5 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到揮發(fā)油。

因為獲得的揮發(fā)油為高濃度易揮發(fā)混合物，GC-MS儀器為高靈敏度檢測儀器，所以檢測時需要進行稀釋。本試驗將揮發(fā)油用正己烷分別稀釋至5 000倍、10 000倍、20 000倍、50 000倍、100 000倍，然后取2 ml加入離心管中，分別取1 μl進樣，分流比為1∶40，進樣后設置5 min的溶劑延遲。

1.3溶劑法

稱取100 g香粉蝶花瓣，剪碎至0.5～1.0 cm小片，并加入200 μl正十二烷，在200 ml的非極性溶劑正己烷和極性溶劑甲醇中分別提取24 h，隨后過濾以去除殘渣得到浸提液。提取過程中每3 h進行一次振蕩混勻，全程在避光條件下進行，溫度為室溫，檢測時分別取1 μl進樣，分流比為1∶40，進樣后設置5 min的溶劑延遲。

1.4SPME法

取2 g香粉蝶完整花瓣，置于40 ml棕色螺口頂空瓶中，并加入4 μl正十二烷，棕色螺口頂空瓶蓋內(nèi)含聚四氟乙烯墊片。萃取頭選用100 μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂層，在60 ℃水浴條件下萃取15 min后立即進樣解析，解析時間為3 min，進樣后不設置溶劑延遲。

1.5質(zhì)譜條件與氣相色譜升溫程序

選用450-GC/320-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀（布魯克公司產(chǎn)品），色譜柱為HP-5毛細管柱，載氣為氦氣（純度99.999%），流速設置為1 ml/min，進樣口溫度設置為250 ℃。

色譜柱升溫程序：50 ℃保持3 min，隨后以5 ℃/min的速度升至180 ℃，再以10 ℃/min的速度升至270 ℃，保持6 min。離子源為電子電離（EI），溫度設定為230 ℃，轟擊電壓70 eV，掃描范圍40～500 amu。

1.6數(shù)據(jù)處理與分析

由布魯克公司色譜工作站完成總離子流圖峰面積的計算，使用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2結果與分析

2.1蒸餾法產(chǎn)物獲得與稀釋倍數(shù)確定

采用蒸餾法提取香粉蝶花瓣的香氣組分，本試驗共消耗新鮮香粉蝶花瓣200 g，獲得香粉蝶花瓣揮發(fā)油1.8 g，出油率為0.9%，揮發(fā)油芳香氣味濃郁，嗅覺感官佳。

將揮發(fā)油按照不同稀釋倍數(shù)進行稀釋，進樣后的結果表明，當樣品稀釋5 000倍和10 000倍時，離子流的信號超出質(zhì)譜檢測器的檢測限度，當稀釋20 000倍時，可在儀器檢測限范圍內(nèi)獲得最大的信號強度。

2.2香粉蝶花瓣香氣成分收集效果的比對

本試驗采用正十二烷作為不同提取方法比對的內(nèi)標物。在不同提取方法中，花瓣的使用量與添加內(nèi)標物量的比值恒定，即每1 g花瓣對應2 μl的正十二烷。對香氣組分進行GC-MS檢測，并對總離子流圖進行修正，使得內(nèi)標物對應的峰面積一致，并將總離子流圖進行堆疊，堆疊結果（圖1）顯示，4份樣品中內(nèi)標物的出峰時間一致，峰形為對稱峰，內(nèi)標物峰面積與總峰面積的比值在合理范圍內(nèi)。

在內(nèi)標物信號強度一致的情況下，蒸餾法檢測的信號強度最高，SPME法次之，溶劑法較差。信號密度方面，蒸餾法和SPME法均有較高的信號密度，溶劑法的信號密度較低，并且用甲醇作為溶劑獲得的信號密度明顯低于用正己烷作為溶劑獲得的信號密度。

蒸餾法處理下樣品的出峰時間集中在8～13 min、18～32 min，該方法所獲得的花瓣香氣成分最多，高達43種，其中鑒定出的成分有32種。SPME法處理下樣品的出峰時間集中在18～35 min，該方法共獲得40種成分，其中鑒定出31種，與蒸餾法的提取效果接近。甲醇作為溶劑的溶劑法處理的樣品出峰時間集中在6～14 min、18～30 min，正己烷作為溶劑的溶劑法處理的樣品出峰時間集中在18～35 min?；诩状甲鳛槿軇┑娜軇┓ê驼和樽鳛槿軇┑娜軇┓ǚ謩e獲得了35種和29種成分，分別鑒定出22種和21種。

在正己烷和甲醇的浸提液中共檢測到24種相同的成分，其中可以鑒定出的成分有17種，另外7種成分雖然未能成功鑒定，但在質(zhì)譜儀中的離子碎片信號特征一致，可視為同一種成分。綜合2種溶劑的提取結果，溶劑法共獲得40種成分，其中鑒定出26種。溶劑法處理下獲得的香氣成分數(shù)量與SPME法相同，但鑒定出的成分數(shù)量低于蒸餾法和SPME法。

基于SPME法鑒定出成分的相對含量為98.19%，在3種提取方法中最高，其次為以甲醇作為溶劑的溶劑法（97.24%），蒸餾法和以正己烷作為溶劑的溶劑法鑒定出成分的相對含量較低，分別為96.04%、96.00%。基于蒸餾法和SPME法獲得的可鑒定含量小于1.00%的成分數(shù)量分別為11個和12個，遠高于溶劑法[以甲醇作為溶劑的溶劑法5個，以正己烷作為溶劑的溶劑法4個]。

2.3香粉蝶花瓣香氣主要成分的鑒定

將含量高于5.00%的成分視為香粉蝶花瓣香氣的主要成分，分別為香葉醇、1，3，5-三甲氧基苯、大根香葉烯-D、丁香酚、別香橙烯、苯乙醇、3，5-二甲氧基苯。其中，3，5-二甲氧基苯和苯乙醇的含量明顯高于其他成分?；谡麴s法和SPME法提取的3，5-二甲氧基苯分別占總組分的56.47%、31.03%，基于溶劑法提取的3，5-二甲氧基苯在總組分中的占比高于20.00%?；赟PME法和溶劑法提取的苯乙醇在總組分中的占比高于10.00%，基于蒸餾法提取的苯乙醇占總組分的6.75%。

3討論

在3種提取方法中，溶劑法處理的樣品在檢測過程中獲得的信號強度較弱，并且鑒定出的香氣成分數(shù)量最少;蒸餾法處理下樣品所獲得的檢測信號強度最強，且鑒定出的香氣成分最多;SPME法處理的樣品雖然在檢測信號強度方面介于蒸餾法與溶劑法之間，但鑒定出的香氣成分種類與蒸餾法接近，且鑒定出的香氣成分的相對含量最高。

除了本研究提到的方法外，揮發(fā)物的收集方法還有超臨界萃取法、吸附-熱脫附法等，但所需設備的體積較大，且價格較為昂貴，不適合在一般實驗室中進行花朵香氣分析試驗[11-12]。SPME法作為一種新型的揮發(fā)物收集方法，具有設備小巧、操作簡便、重復性高等特點[13-15]。本試驗中，SPME法對樣品的需求量最小，操作簡便，且有較高的檢測效率。

香粉蝶花瓣的香氣成分中，最主要的2種成分是3，5-二甲氧基苯和苯乙醇。蒸餾法提取的苯乙醇在總組分中的占比低于SPME法和溶劑法，可能是因為苯乙醇的相對分子質(zhì)量較小，沸點較低，在蒸餾的高溫環(huán)境下流失嚴重[12]，也可能是因為蒸餾法處理下3，5-二甲氧基苯的提取效率較高，該成分在總組分中占比過高，導致其他成分的相對含量較低[16]。

3，5-二甲氧基苯和1，3，5-三甲氧基苯是眾多香水月季花朵香氣中共有的成分，也是香水月季清新香氣的主要成分，香粉蝶花朵的氣味與傳統(tǒng)香水月季類似[17-18]。香粉蝶花朵香氣的主要成分中有香葉醇，而香葉醇多為原產(chǎn)于歐洲的薔薇屬花朵香氣中的主要成分，說明在香粉蝶的育種過程中可能有歐洲薔薇屬植物的基因摻入[17，19]。

本研究綜合比較了3種提取方法處理下香粉蝶花朵香氣成分的收集效果，并確定了大花藤本月季香粉蝶花朵香氣的主要成分，可以為今后月季芳香型品種的選育以及香氣合成機制的研究提供理論指導。

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（責任編輯：王妮）