通脈膠囊微生物限度檢查方法的驗證

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院（300052）李彬

通脈膠囊是由丹參、赤芍、草決明、郁金、莪術、王不留行等8味中藥組成的中藥制劑，具有活血行氣，安神寧心的功效。根據(jù)《中國藥典》2010年版的規(guī)定，藥品在進行微生物限度檢查前必須對其檢查方法進行驗證，以確認該供試品所采用的檢查方法無抑菌作用后在進行檢查，才能真實反映該藥品受污染的程度[1]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LIBRORAEG120電子天平（川本島津）；YJA電動勻漿儀（臺州市椒江五星機械儀器有限公司）；MJX-1501培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥與培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號080919），玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號080606），膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號080528），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號070111），pH7.0的無菌氫氧化鈉-蛋白胨緩沖液（批號070413），改良馬丁培養(yǎng)基（批號080408），均為中國藥品生物制品檢定所提供；通脈膠囊（批號20110605）。

1.3 菌種 大腸埃希菌[CMCC(B)44102]，金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉[CMCC(F)98003]，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于30℃～35℃培養(yǎng)18～24小時；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)18小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)約為50～100cfu的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7天后加入4mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫后，用管口帶有薄的無菌棉花吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)約為50～100cfu的孢子懸液。

2.2 供試液的制備 取本品10g，加pH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，用勻漿儀，混勻，作為1:10的供試液。

2.3 方法驗證

2.3.1 細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)的驗證

2.3.1.1 細菌計數(shù)的驗證

2.3.1.1.1 試驗組 ①常規(guī)法：取2.2項下制備的供試液1mL和1mL試驗菌（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝。每株試驗菌平行制備2個平皿。在30℃～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，點計菌落數(shù)，取均值。②培養(yǎng)基稀釋法：取2.2項下制備的供試液2mL，每1mL等量分注5個平皿，即每皿0.2mL，每皿中加入1mL試驗菌（約50～100cfu），立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝。培養(yǎng)時間與常規(guī)法相同。

2.3.1.1.2 菌液組 取1mL試驗菌（約50～100cfu），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，按平皿法測定所加的試驗菌數(shù)（分別為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌）。

2.3.1.1.3 供試品 對照組按試驗組的方法，不加菌懸液，按菌落計數(shù)方法測定供試品菌數(shù)（本底菌）。

2.3.1.1.4 稀釋劑 對照組取與供試液等量的稀釋劑和菌懸液1mL注入1個平皿中，培養(yǎng)基注皿，培養(yǎng)，計數(shù)。

2.3.1.2 霉菌和酵母菌計數(shù)的驗證

2.3.1.2.1 試驗組 ①常規(guī)法：取2.2項下制備的供試液1mL和1mL試驗菌（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝。每株試驗菌平行制備2個平皿。在23℃～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，點計菌落數(shù)，取均值。②培養(yǎng)基稀釋法：取2.2項下制備的供試液2mL，每1mL等量分注5個平皿，即每皿0.2mL，每皿中加入1mL試驗菌（約50～100cfu），立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝。培養(yǎng)時間與常規(guī)法相同。

2.3.1.2.2 菌液組 取1mL試驗菌（約50～100cfu），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，按平皿法測定所加的試驗菌數(shù)（分別為白色念珠菌和黑曲霉菌）。2.3.1.2.3 供試品 對照組按試驗組的方法，不加菌懸液，按菌落計數(shù)方法測定供試品菌數(shù)（本底菌）。

2.3.1.2.4 稀釋劑 對照組取與供試液等量的稀釋劑和菌懸液1mL注入1個平皿中，培養(yǎng)基注皿，培養(yǎng)，計數(shù)。試驗組菌回收率=（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/試驗組菌落數(shù)×100%；稀釋劑對照組回收率=稀釋劑對照組菌落數(shù)/試驗組菌落數(shù)×100%?！吨袊幍洹芬?guī)定對各試驗菌株的回收率均不得低于70%。用常規(guī)法測定該品種對5個試驗菌株的回收率，以確定其抑菌程度（見附表1）。

由附表1可知，本品對大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉無抑菌作用，而對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用。采用培養(yǎng)劑稀釋法測定各試驗菌株的回收率（見附表2）。

由附表2可知，采用培養(yǎng)劑稀釋法可有效消除藥品對各試驗菌株的抑菌作用。

2.3.2 控制菌檢查法的驗證 （見附表3）

2.3.2.1 大腸埃希菌檢查法的驗證

2.3.2.1.1 試驗組 取10mL 2.2項下制備的供試液和1mL大腸埃希菌（約50～100cfu）加入100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時。

2.3.2.1.2 陰性菌對照組 取10mL 2.2項下制備的供試液和1mL金黃色葡萄球菌（約50～100cfu）加入100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時。

2.3.2.1.3 陽性對照組 取1mL 大腸埃希菌（約50～100mL）加入100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時。取試驗組、陰性菌對照組和陽性對照組上述培養(yǎng)物各0.2mL，分別接種至含5mL MUG培養(yǎng)基的試管內培養(yǎng)，于5、24小時在366nm紫外光下觀察，試驗組管MUG陽性，靛基質陽性；陰性菌對照組MUG陰性，靛基質陰性；陽性對照組管MUG陽性，靛基質陽性。

2.3.2.1.4 試驗結果 陽性對照組檢出大腸埃希菌；陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌；試驗組檢出大腸埃希菌。驗證結果符合要求。

附表1 常規(guī)法測定各試驗菌株的回收率（%）

附表2 培養(yǎng)劑稀釋法測定各試驗菌株的回收率（%）

附表3 控制菌驗證結果

2.3.2.2 大腸菌群檢查法的驗證

2.3.2.2.1 試驗組 取1mL 2.2項下制備的供試液和1mL大腸埃希菌（約50～100cfu）加入到10mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時。

2.3.2.2.2 陰性菌對照組 取1mL 2.2項下制備的供試液和1mL金黃色葡萄球菌（約50～100cfu）加入到10mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時。

2.3.2.2.3 陽性對照菌 取1mL 2.2項下制備的供試液和1 m L大腸埃希菌（約50～100cfu）加入到10mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時。試驗組管和陽性對照組管均有菌生長且產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性菌對照組無菌生長且不產(chǎn)酸產(chǎn)氣。結果：試驗組檢出大腸菌群；陰性菌未檢出大腸菌群；陽性對照組檢出大腸菌群。

2.3.2.3 供試品控制菌檢查 取10mL 2.2項下制備的供試液置100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查，結果顯示，樣品每1g中未檢出大腸埃希菌。

2.4 結果 試驗結果顯示，細菌計數(shù)采用培養(yǎng)劑稀釋法；霉菌和酵母菌計數(shù)采用平皿法；控制菌采用常規(guī)法。

3 討論

中藥制劑的微生物限度檢查通常是按常規(guī)的藥品衛(wèi)生學檢驗方法進行細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)的。由于中成藥是含有多種成分的復方制劑，其中任何具有抑菌作用的成分均可影響微生物限度檢查的準確性[2]。因此，本試驗以5種陽性對照菌的回收率作為評價指標，確定了通脈膠囊的微生物限度檢查方法。該方法可用于通脈膠囊微生物的質量控制。