不同日齡王錦蛇小腸大小、組織學(xué)參數(shù)和酶活性的變化

姚利，劉溯源，伍亮，徐文寧，吳文欣，吳海燕，王鑫，高樂文，張志強(qiáng)*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與計算機(jī)學(xué)院，安徽 合肥 230036)

表型可塑性(phenotypic plasticity)是指在環(huán)境影響下，某一基因型在表型上產(chǎn)生變異的能力。食物可誘導(dǎo)成體爬行動物的消化系統(tǒng)在器官大小、組織學(xué)和生理學(xué)層次表現(xiàn)出可塑性[1-3]。幼蛇的早期生活史階段，如出殼、蛻皮和開口攝食的早晚及成功率，不但能影響其后續(xù)的生活史進(jìn)程，也是蛇類養(yǎng)殖需要解決的主要難題之一[4]，但關(guān)于蛇類組織器官發(fā)育可塑性(developmental plasticity)的研究較少[5-9]。幼蛇的免疫功能隨日齡增加而逐漸完善[5-6]，且受食物蛋白濃度的影響[7]；30日齡內(nèi)虎斑頸槽蛇(Rhabdophistigrinus)的小腸組織學(xué)參數(shù)[8]及50日齡內(nèi)滑鼠蛇(Ptyasmucocus)消化道5-羥色胺細(xì)胞的形態(tài)和分布密度[9]，均在開口攝食前后變化較大。目前，與體重、體長和體全長等整體反映蛇體健康狀態(tài)和營養(yǎng)水平的指標(biāo)相比[10-12]，對不同生活史階段蛇類小腸大小、組織學(xué)參數(shù)和消化酶活性的變化仍缺乏研究。

王錦蛇(Elaphecarinata)屬于游蛇科(Colubridae)錦蛇屬動物，是一種適于人工養(yǎng)殖的無毒蛇，幼蛇喜食蛋白含量高的人工配合飼料，但難以消化淀粉類物質(zhì)[7,13]。本研究選取出殼后3、7～10、20、30、40和50日齡的王錦蛇幼蛇，測定其身體及小腸長度和重量、組織學(xué)參數(shù)和消化酶活性的變化，以闡明小腸形態(tài)和功能建立，及其與特定生活史階段的關(guān)系，為王錦蛇幼蛇開口餌料研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

于2018年8月上旬從池州市龍井山蛇類馴養(yǎng)專業(yè)合作社購買10窩王錦蛇蛇蛋，每窩10個。在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生理生態(tài)學(xué)實驗室內(nèi)孵化蛇蛋，空調(diào)控制室溫為(28 ± 2) ℃。將同一窩蛇蛋置于同一個長×寬×高=25 cm×12 cm×20 cm的塑料盒中，盒底鋪手握不松散的濕沙，盒上方覆蓋不滴水的濕紗布，孵化濕度為80%左右。將不同窩同一日齡出殼的幼蛇，置于同一爬寵飼養(yǎng)盒(長×寬×高=28 cm×18 cm×15 cm)內(nèi)飼養(yǎng)，水自取，首次蛻皮后開始喂食乳鼠或脫毛雛雞，每隔3～5 d投喂1次。取出殼后3、7～10 (首次蛻皮)、20、30、40和50日齡的王錦蛇，至同一日齡組達(dá)到8條幼蛇為止。

1.2 主要試劑和用品

蘇木精、伊紅、蛋白酶活性測定試劑由合肥博美生物科技有限責(zé)任公司提供；苦味酸、甲醛由合肥志宏生物技術(shù)有限公司提供；95%乙醇、無水乙醇、二甲苯由合肥中皖化學(xué)試劑有限公司提供；考馬斯亮藍(lán)法(A045-2)、麥芽糖酶(A082-3)和海藻糖酶(A149)活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司。生物組織用分析純固體石蠟(熔點(diǎn)：58～60 ℃)、載玻片、蓋玻片、中性樹膠、直尺、塑料盒、爬寵飼養(yǎng)盒等均為市售產(chǎn)品。

1.3 動物解剖和組織學(xué)參數(shù)測定

測定王錦蛇幼蛇的體重和體全長后，斷頭處死，解剖取出消化道，測量小腸長度和濕重后，截取小腸前段、中段和后段各約1 cm，投入不含冰醋酸的Bouin氏液固定18～24 h后，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚5 μm。采用改良的Harris蘇木精染液[14]顯示小腸前段、中段和后段各部位的組織學(xué)參數(shù)。剩余小腸組織稱重后，-20 ℃冷凍保存，用于測消化酶活性。重長比(g/cm)=體重(g)/體全長(cm)；小腸濕重指數(shù)(%)=小腸濕重(g) × 100/體重(g)；小腸長度指數(shù)(%)=小腸長度(cm) × 100/體全長(cm)。

使用數(shù)碼顯微鏡觀察，拍照。利用Motic Images Plus 2.0軟件測量小腸前段、中段和后段組織學(xué)參數(shù)[15]，即橫截面直徑(40×，圖1A)、肌層厚度(100×，圖1B)、絨毛高度(從圓形平滑肌層的內(nèi)側(cè)邊緣至黏膜層的最外緣，100×，圖1B)及腸道柱狀上皮細(xì)胞短徑與長徑(位于絨毛頂端的腸道柱狀上皮細(xì)胞，400×，圖1C)。每條幼蛇小腸前段、中段和后段各隨機(jī)選取1張切片，每張切片上的同一組織學(xué)參數(shù)計數(shù)3次，以其平均值表示該條幼蛇前段、中段或后段組織學(xué)參數(shù)的大小，以8條幼蛇的平均值表示該發(fā)育階段小腸前段、中段或后段組織學(xué)參數(shù)的大小。

A. 小腸中段直徑(D)；B. 小腸中段肌層厚度(ME)和絨毛高度(VH)；C. 小腸中段柱狀上皮細(xì)胞短徑(箭頭所指，ED)和長徑(EH)

1.4 消化酶活性測定

1.4.1 組織勻漿

取小腸組織0.2～1 g，在冰冷的生理鹽水中漂洗剪碎，放入玻璃勻漿管中，用可調(diào)高速勻漿機(jī)在10 000～15 000 r/min條件下研磨成20%組織勻漿液，2 000 r/min離心15 min，取上清液備用。

1.4.2 消化酶活性測定

小腸組織蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法按試劑說明書測定；之后，按照麥芽糖酶、海藻糖酶活性測定試劑盒說明書，用722型分光光度計，分別在505 nm和550 nm處比色，測定吸光值。一定條件下(37 ℃、pH=6.0)麥芽糖酶活性大小定義為：1 mg蛋白組織每分鐘水解1 nmol麥芽糖為一個酶活性單位(IU/mg prot)；海藻糖酶活性大小按照蛋白濃度計算，1 mg底物每分鐘水解1 nmol海藻糖為一個酶活性單位(IU/mg prot)。

采用福林酚法測定蛋白酶活性，水浴溫度為35 ℃[16]。通過標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液(100 μg/mL)設(shè)置6個濃度梯度，與Na2CO3溶液和福林酚試劑混合后，在680 nm下比色測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。之后，采用福林酚試劑法測樣品的蛋白酶活性，以10%三氯乙酸中止反應(yīng)，680 nm下比色測定吸光值。蛋白酶活性的定義為：35 ℃、pH 7.5條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為一個酶活性單位(IU/g prot)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用SPSS 19.0 for windows進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用單因素方差分析(One-way ANOVA)及多重比較(Multiple comparisons) Post hoc test統(tǒng)計出殼后3、7～10、20、30、40和50日齡組王錦蛇體重、體全長、重長比、小腸濕重指數(shù)、小腸長度指數(shù)、組織學(xué)參數(shù)(直徑、肌層厚度、絨毛高度、腸道柱狀上皮細(xì)胞短徑和長徑)和消化酶(麥芽糖酶、海藻糖酶和蛋白酶)活性的組間差異。文中數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 王錦蛇體重、體長、重長比和小腸大小的變化

王錦蛇體重各組間無顯著差異(F5，42=2.029，P>0.05，圖2A)，體全長50日齡組顯著長于3日齡組(F5，42=3.330，P<0.05，圖2B)，其他日齡各組之間都無顯著差異；重長比3日齡組顯著高于20、30和40日齡組(F5，42=4.191，P<0.05，圖2C)，7～10和50日齡組與任一日齡組均無顯著差異；小腸長度指數(shù)30日齡組與20、40和50日齡組接近，但顯著高于3日齡組和7～10日齡組(F5，42=10.559，P<0.05，圖2D)；小腸濕重指數(shù)50日齡組最高，且顯著高于其他日齡組，3日齡組小腸濕重指數(shù)最低(F5，42=8.305，P<0.05，圖2E)。

注：柱形圖上標(biāo)注的小寫字母不同，表示日齡間的差異顯著(P<0.05)，小寫字母相同表示日齡間差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 王錦蛇小腸組織學(xué)參數(shù)的變化

小腸前段直徑3日齡組最高，7～10日齡組其次，3日齡組顯著高于20和40日齡組(F5，42=5.048，P<0.05)，中段(F5，42=0.639，P>0.05)和后段(F5，42=1.602，P>0.05)無日齡差異。小腸前段肌層厚度3和50日齡組都顯著高于20日齡組(F5，42=3.907，P<0.05)，中段50日齡組顯著高于30日齡組(F5，42=2.704，P<0.05)，后段(F5，42=1.225，P>0.05)無日齡差異。小腸前段絨毛高度3日齡組最高，50日齡組其次，3日齡組顯著高于除50日齡組外的其他日齡組(F5，42=7.395，P<0.05)，中段無日齡差異(F5，42=0.858，P>0.05)，后段50、30和20日齡組都顯著高于40日齡組(F5，42=3.941，P<0.05)。小腸前段柱狀上皮細(xì)胞短徑3和30日齡組顯著高于7～10日齡組(F5，42=3.769，P<0.05)，中段3日齡組顯著高于20和40日齡組(F5，42=2.517，P<0.05)，后段(F5，42=1.712，P>0.05)無日齡差異。小腸前段柱狀上皮細(xì)胞長徑50日齡組顯著高于7～10日齡組(F5，42=3.881，P<0.05)，中段(F5，42=2.258，P>0.05)和后段(F5，42=1.489，P>0.05)無日齡差異(表1)。

表1 王錦蛇小腸前段、中段和后段組織學(xué)參數(shù)的增齡變化

麥芽糖酶活性呈波浪形波動，但日齡組間的差異不顯著(F5,42=2.218，P>0.05，圖3A)；海藻糖酶活性3日齡和7～10日齡組都顯著高于50日齡組(F5,42=5.204，P<0.05，圖3B)，其他日齡組間的差異不顯著；蛋白酶活性40日齡組顯著高于3日齡組(F5,42=4.334，P<0.05，圖3C)，其他日齡組間的差異不顯著。

圖3 王錦蛇小腸麥芽糖酶(A)、海藻糖酶(B)和蛋白酶活性(C)的變化

3 討論

在蛇類生長發(fā)育的早期階段，與體重、體全長等相比，重長比這一指標(biāo)能更全面地反映蛇體的健康狀態(tài)，具有可塑性[5-7, 17]。與灌喂8%、12%和24%蛋白含量的食物組相比，16%和20%蛋白含量食物組的王錦蛇的重長比增幅最快[7]。50日齡內(nèi)，滑鼠蛇的重長比3～20日齡階段增長緩慢，之后快速增加，至50日齡達(dá)到最高值[6]。然而，與滑鼠蛇不同，本研究發(fā)現(xiàn)王錦蛇的重長比以3日齡時為最高，20～40日齡下降，至50日齡后又回升，這可能與其初生重重于滑鼠蛇有關(guān)[6]。王錦蛇出殼后體內(nèi)含有來源于胚胎時期的大量脂肪，可供首次蛻皮前的幼蛇消耗使用，且隨日齡增加而逐漸減少。與出殼后3 d相比，王錦蛇在首次蛻皮和開口攝食前后，其體重均有小幅度下降，但體全長逐漸變長，故重長比趨于降低。本研究以乳鼠刺激王錦蛇開口攝食，開口后喂食脫毛雛雞，乳鼠和雛雞都是王錦蛇喜好的食物，幼蛇從食物中獲得營養(yǎng)物質(zhì)后，其生長發(fā)育速度加快，所以重長比趨于增加。

成體兩棲爬行動物小腸大小和組織學(xué)參數(shù)的可塑性與季節(jié)[18]、饑餓脅迫[19]等因素有關(guān)，小腸重量可能先于長度改變[3]，消化酶活性隨季節(jié)而波動，但不受食物成分影響[20]。王錦蛇出殼后小腸大小、組織學(xué)參數(shù)和消化酶活性都發(fā)生了適應(yīng)性改變，可能與其食性及早期復(fù)雜的生活史有關(guān)。野外條件下，王錦蛇食性廣泛，可捕食鼠、鳥、鳥蛋及其他小型動物[4]，本研究以乳鼠和脫毛雛雞作為王錦蛇的食物來源，能滿足其生長發(fā)育需要[7]。50日齡內(nèi)，王錦蛇經(jīng)歷了出殼、首次蛻皮和開口攝食等多個關(guān)鍵生活史階段，小腸長度和濕重指數(shù)分別在30和50日齡組最高，長度先于濕重發(fā)生改變，與成體對饑餓的反應(yīng)相反[19]，這可能與在食物資源充足情況下，幼蛇囫圇吞食且貪食，開口后攝食頻率較高，需要更大的空間及更長的時間來處理和消化食物有關(guān)。小腸是執(zhí)行消化吸收功能的主要場所，從前段至后段消化吸收能力逐漸減弱[4]。本研究發(fā)現(xiàn)王錦蛇小腸前段的直徑、肌層厚度、絨毛高度、腸道細(xì)胞短徑和長徑等參數(shù)都在3和/或50日齡組最高，7～10、20或30日齡組最低，呈現(xiàn)出先降后升的變化趨勢，說明40～50日齡小腸的形態(tài)發(fā)育仍未趨于穩(wěn)定，晚于虎斑頸槽蛇的30日齡[8]。王錦蛇小腸中段柱狀上皮細(xì)胞的短徑3日齡組顯著高于20和40日齡組，肌層厚度50日齡組顯著高于30日齡組，但柱狀上皮細(xì)胞的長徑無明顯變化，小腸后段的絨毛高度在40日齡組顯著下降，這可能與其消化生理狀態(tài)有關(guān)，緊縮的短徑和萎縮的絨毛有助于蛇體節(jié)約能量[2,19]。與小腸前段組織學(xué)參數(shù)的變化不同，王錦蛇小腸麥芽糖酶活性無明顯的日齡差異，這與其對淀粉類物質(zhì)消化能力較差有關(guān)[11,13]。然而，海藻糖酶活性3日齡組和7～10日齡組均顯著高于50日齡組，說明王錦蛇出殼后和開口攝食前的體內(nèi)脂肪經(jīng)代謝后可轉(zhuǎn)化為糖原，而海藻糖酶是廣泛存在于小腸上皮細(xì)胞膜刷狀緣的一種胞外酶，能催化水解一分子海藻糖生成兩分子葡萄糖[20]，王錦蛇早期生活史階段小腸海藻糖酶含量較高，這有利于其存活。海藻糖酶活性在王錦蛇主動攝食后趨于下降，并在50日齡組達(dá)到最低值，而蛋白酶活性40日齡組顯著高于3日齡組，說明開口攝食后以水解糖類為主的酶類鈍化，蛋白水解酶活性增強(qiáng)，這與小腸消化和吸收功能的建立相匹配，建議可在40～50日齡期間提高王錦蛇食物中的蛋白含量、加大投喂頻率。

4 結(jié)論

本研究首次從小腸大小、組織學(xué)參數(shù)和消化酶活性整合變化的角度證實了蛇類小腸的發(fā)育可塑性，提示王錦蛇的消化吸收功能雖已建立，但小腸發(fā)育尚需完善，建議40日齡后可謹(jǐn)慎投喂體積較大、低淀粉高蛋白含量的食物。