一株番茄表面著生醋酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸條件優(yōu)化

鐘彩霞,田佳雪,王曉琪,溫彤*

1.包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品生物與檢測系, 內(nèi)蒙古 包頭 014030; 2.包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 內(nèi)蒙古 包頭 014030

食醋是一種歷史悠久的酸性調(diào)味品，其多以谷物等食材為原料經(jīng)醋酸菌等微生物發(fā)酵而成，具有獨(dú)特風(fēng)味以及豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1-3]。近現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及營養(yǎng)學(xué)研究表明，食醋具有一定的保健及藥理功能[4-7]。近年來，為了獲得更為廣闊的市場，基于傳統(tǒng)食醋而開發(fā)出的新產(chǎn)品層出不窮，果醋便是其中的代表產(chǎn)品之一。與傳統(tǒng)食醋相比，果醋口感更好，種類更為豐富且可以直接飲用，因而具有廣闊的市場前景[8-10]。目前果醋的生產(chǎn)主要以不同水果為原料，以醋酸菌為發(fā)酵菌株進(jìn)行釀造生產(chǎn)。而生產(chǎn)所用菌株的特性如生長速率、產(chǎn)酸能力、代謝中間產(chǎn)物耐受力及副產(chǎn)物種類及含量等，往往是決定產(chǎn)品產(chǎn)量、風(fēng)味及品質(zhì)的重要因素[11-14]。因此，性狀優(yōu)良的菌種對于高品質(zhì)食醋的生產(chǎn)至關(guān)重要。

醋酸菌是一類能夠在體內(nèi)氧化乙醇產(chǎn)生乙酸的微生物，目前已分離得到的醋酸菌大多歸于醋酸桿菌屬(Acetobacter)和醋酸單胞菌屬(Acetomonas)。其細(xì)胞形態(tài)多呈桿狀或橢圓形，以單個(gè)、成對或鏈狀排列[15-18]。幼齡菌多呈革蘭氏染色陰性，老齡菌呈不穩(wěn)定狀態(tài)[19]。醋酸菌的最大特點(diǎn)為能夠在有氧條件下將乙醇氧化為乙酸，這一特點(diǎn)也使其在食品工業(yè)尤其是食醋釀造領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用[20-22]。

番茄作為一種常見果蔬，因來源廣泛、口味獨(dú)特且富含營養(yǎng)物質(zhì)而成為果醋釀造的理想原料，但目前工業(yè)生產(chǎn)中常用作果醋釀造的醋酸菌在以番茄為原料的果醋釀造過程中均無法良好生長，因而，獲得一株具有較強(qiáng)醋酸生產(chǎn)能力并可在以番茄為基質(zhì)的環(huán)境中良好生長的菌株對于番茄果醋的生產(chǎn)釀造具有重要意義?；诖耍狙芯恳苑褳閷?shí)驗(yàn)材料，對著生于其表面能夠很好利用番茄營養(yǎng)成分進(jìn)行生長繁殖的產(chǎn)醋酸微生物進(jìn)行分離鑒定，并對其中一株生長及產(chǎn)醋酸能力較強(qiáng)的菌種進(jìn)行產(chǎn)酸條件優(yōu)化，從而為高品質(zhì)番茄果醋的釀造提供性狀優(yōu)良的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：待分離樣品取自內(nèi)蒙古西部地區(qū)種植番茄表面。

酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉、瓊脂糖購自北京酷來搏科技有限公司；葡萄糖、碳酸鈣、三氯化鐵(FeCl3)、氫氧化鈉(NaOH)、七水合硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、硫酸銨[(NH4)2SO4]、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、尿素、氯化銨(NH4Cl)均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糖蜜、豆餅粉購自北京索萊寶科技有限公司；2×Pfu PCR mix、Gel strain購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-103B恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；UV759紫外可見分光光度計(jì)(上海佑科公司)；E200-雙目光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)；Veriti熱循環(huán)儀、SorvallTMST-16離心機(jī)(美國Thermo fisher公司)。

1.3 方法

1.3.1培養(yǎng)基的配制 富集培養(yǎng)基：酵母提取物2.5%，葡萄糖2.5%，pH自然，121℃高壓濕熱滅菌20 min；分離鑒定培養(yǎng)基：酵母提取物3%，葡萄糖3%，碳酸鈣3%，瓊脂1.5% (固體培養(yǎng)基添加)，pH自然，121 ℃高壓濕熱滅菌20 min，接種前加入4%無水乙醇；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母提取物1%，葡萄糖1%，pH自然，121℃高壓濕熱滅菌20 min；銨鹽利用檢測培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.25 g·L-1，(NH4)2SO41 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，KH2PO40.1 g·L-1，F(xiàn)eCl30.005 g·L-1，無水乙醇3%；甘油生酮實(shí)驗(yàn)平板培養(yǎng)基：甘油 30 g·L-1、酵母膏 30 g·L-1、瓊脂 15 g·L-1；生二酮葡糖糖酸實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g·L-1、蛋白胨 10 g·L-1、酵母膏 1.5 g·L-1、K2HPO41 g·L-1；產(chǎn)γ-吡喃酮實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖40 g·L-1、酵母提取物10 g·L-1、碳酸鈣30 g·L-1。

1.3.2產(chǎn)醋酸微生物的初篩 醋酸生產(chǎn)菌可以通過代謝產(chǎn)生的乙酸分解分離鑒定培養(yǎng)基中不溶性碳酸鈣而形成透明圈。通過此方法能夠自分離平板中初步篩選可產(chǎn)生醋酸的微生物。

取采集自內(nèi)蒙古西部地區(qū)番茄表面樣品，無菌狀態(tài)下用手術(shù)刀切割為合適大小后接種至100 mL富集培養(yǎng)基中，30℃,200 r·min-1培養(yǎng)72 h，至培養(yǎng)基渾濁且表面生成菌膜。取培養(yǎng)產(chǎn)物100 μL，均勻涂布于分離鑒定固體培養(yǎng)基表面，30℃靜置培養(yǎng)至表面有單菌落生成，挑取3個(gè)周邊形成透明圈的單菌落(初步鑒定為產(chǎn)酸菌)，分別接種至液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃,200 r·min-1培養(yǎng)24 h。

1.3.3醋酸生產(chǎn)菌的定性檢測 利用乙酸與三氯化鐵能夠在偏堿性條件下發(fā)生反應(yīng)生成紅褐色氫氧化鐵沉淀的原理，可對待測微生物培養(yǎng)液中的醋酸進(jìn)行定性檢測，并以此初步證實(shí)待測微生物具有乙酸生產(chǎn)能力。取培養(yǎng)至對數(shù)期培養(yǎng)產(chǎn)物10 mL，12 000 r·min-1離心1 min，取上清，以0.1 mol·L-1NaOH溶液中和至pH 7.0，加入數(shù)滴5% FeCl3，觀察是否有紅色沉淀生成，從而確定待測菌株是否具有醋酸生產(chǎn)能力。

1.3.4產(chǎn)醋酸菌的生理生化鑒定 ①銨鹽利用實(shí)驗(yàn)。以1%接種量分別接種初篩得到的3株產(chǎn)醋酸菌至銨鹽利用檢測培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長情況，從而推測其銨鹽利用能力。

②甘油生酮實(shí)驗(yàn)。以單菌落劃線方式將待測菌接種至甘油生酮實(shí)驗(yàn)平板培養(yǎng)基上。30 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)基中加入斐林試劑，觀察是否有紅色沉淀出現(xiàn)。

③生二酮葡糖糖酸實(shí)驗(yàn)。以1%接種量分別接種初篩得到的3株產(chǎn)醋酸菌至生二酮葡糖糖酸實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)產(chǎn)物上清3 mL，加入1 mL斐林試劑，沸水浴加熱混合物10 min，觀察顏色變化。

④產(chǎn)γ-吡喃酮實(shí)驗(yàn)。以1%接種量分別接種初篩得到的3株產(chǎn)醋酸菌至產(chǎn)γ-吡喃酮實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)產(chǎn)物上清3 mL，加入數(shù)滴1% FeCl3溶液，若溶液變?yōu)樽霞t色，則說明培養(yǎng)基中含有γ-吡喃酮。

⑤觸酶實(shí)驗(yàn)。挑取少量待測菌至預(yù)先滴加至載玻片上的5%過氧化氫溶液中，觀察是否有氣泡生成，以此驗(yàn)證待測菌中是否合成過氧化物酶。

1.3.5菌株16S rRNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 ①細(xì)菌全基因組提取。以1%接種量分別接種初篩得到的3株產(chǎn)醋酸菌至25 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h。按照基因組提取試劑盒說明書對待測菌株全基因組進(jìn)行提取。

②16S rRNA編碼基因的擴(kuò)增。以待測菌全基因組為模板，利用高保真DNA聚合酶對16S rRNA編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增 (引物序列：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 120 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離回收后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行序列測定，并根據(jù)測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6菌株產(chǎn)酸條件優(yōu)化 ①不同溶氧對菌株醋酸產(chǎn)量的影響。以1%接種量將菌種接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在不同搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)菌株(梯度設(shè)置：50、100、150、200、250 r·min-1)，分別測定不同條件下菌株的生長及產(chǎn)醋酸情況。

②不同溫度對菌株醋酸產(chǎn)量的影響。以1%接種量將菌種接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在最適搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)菌株，分別測定不同溫度梯度(梯度設(shè)置：25.0、27.5、30.0、32.5、35.0 ℃)條件下菌株的生長及產(chǎn)醋酸情況。

③不同碳氮源對菌株醋酸產(chǎn)量的影響。分別以1%葡萄糖、1%乳糖、1%蔗糖、1%可溶性淀粉、1%糖蜜為碳源，以1%酵母提取物、1%蛋白胨、1%尿素、1%NH4Cl、1%豆餅粉為氮源，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定12、24、36、48 h，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，測定不同碳氮源組合條件下菌株在不同生長時(shí)間內(nèi)的醋酸生產(chǎn)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)醋酸菌的分離及初篩

取3株菌進(jìn)行革蘭氏染色及光學(xué)顯微鏡形態(tài)觀察，結(jié)果如圖1所示，表明3株菌均呈近似橢圓的短桿狀，其中BQ-3屬于革蘭氏陽性菌，BQ-1、BQ-2屬于革蘭氏陰性菌(圖1A)。

2.2 醋酸生產(chǎn)菌的定性檢測

對3株通過初篩培養(yǎng)基篩選得到的菌株進(jìn)行產(chǎn)醋酸能力定性分析，結(jié)果表明3株菌液體培養(yǎng)物上清液均具有使堿性三氯化鐵溶液變渾濁的能力，證明3株待測菌均具備醋酸生產(chǎn)能力(圖1B)。

A：分離自番茄表面3株產(chǎn)醋酸菌(BQ-1、BQ-2、BQ-3)的革蘭氏染色鑒定。B：分離自番茄表面3株產(chǎn)醋酸菌(BQ-1、BQ-2、BQ-3)產(chǎn)醋酸能力的定性檢測，以巴氏醋酸桿菌滬釀1.01(Acetobacter pasteurianus Huniang 1.01)為正對照。圖1 番茄表面產(chǎn)醋酸菌的初篩Fig.1 Primary screening of acetic acid-producing bacteria on tomato surface

2.3 產(chǎn)醋酸菌的生理生化特征分析

以滬釀1.01(AcetobacterpasteurianusHuniang 1.01，ApH. 1.01)菌株為對照，分別通過銨鹽利用實(shí)驗(yàn)、甘油生酮實(shí)驗(yàn)、生二酮葡糖糖酸實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)γ-吡喃酮實(shí)驗(yàn)及觸酶實(shí)驗(yàn)對3株待測菌的生理生化特征進(jìn)行分析，從而為3株菌的種類鑒定提供分析依據(jù)，結(jié)果見表1。上述結(jié)果表明所分離的3株菌均具有醋酸生產(chǎn)能力，可以利用銨鹽，具有好氧生長特點(diǎn)，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[23]并與對照菌株滬釀1.01表型相比較，初步推斷3株細(xì)菌均為醋酸菌，但菌株BQ-3對于多醇類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化能力較低，推測其與BQ-1、BQ-2種屬關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 產(chǎn)醋酸菌16S rRNA編碼基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

16S rRNA編碼基因是一段廣泛存在于原核生物基因組上的細(xì)菌染色體上的DNA序列，負(fù)責(zé)編碼核糖體16S RNA，在細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最常用。分別提取3株待測菌株基因組DNA，以其為模板擴(kuò)增16S rRNA編碼基因(圖2A)，測序后使用MEGA 7.0軟件，進(jìn)行發(fā)育樹構(gòu)建，如圖2B所示，表明3株菌鑒定結(jié)果分別為：BQ-1為醋桿菌科(Acetobacteraceae),醋酸桿菌屬(Acetobacter)細(xì)菌；BQ-2為莫拉氏菌科(Moraxellaceae),不動桿菌屬(Acinetobacter)細(xì)菌；BQ-3為明串珠菌科(Leuconostocaceae),明串珠菌屬(Leuconostoc),腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。根據(jù)生理生化鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，初步證實(shí)菌株BQ-1屬于醋酸桿菌屬，選取該菌株用于后續(xù)研究。

2.5 菌株產(chǎn)酸條件優(yōu)化

2.5.1不同溶氧對菌株產(chǎn)酸的影響 在不同搖床轉(zhuǎn)速下(導(dǎo)致培養(yǎng)基中溶氧量不同)分別培養(yǎng)菌株，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)速相對較低時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)菌體生長及醋酸產(chǎn)量隨轉(zhuǎn)速提高而上升，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r·min-1后，轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酸及生長不再產(chǎn)生顯著影響，表明該菌對于氧氣的消耗能力較強(qiáng)，為好氧菌，并以該條件作為菌株生長的最佳搖床轉(zhuǎn)速(圖3A)。

A：分離自番茄表面3株產(chǎn)醋酸菌(BQ-1、BQ-2、BQ-3)的16S rRNA編碼基因擴(kuò)增；B：基于分離自番茄表面3株產(chǎn)醋酸菌(BQ-1、BQ-2、BQ-3)的16S rRNA編碼基因序列所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2 番茄表面產(chǎn)醋酸菌的分子生物學(xué)種類鑒定Fig.2 Molecular biological species identification of acetic acid-producing strains isolated from tomato surface

2.5.2不同培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酸的影響 在不同溫度條件下培養(yǎng)菌株，并對培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，菌株生產(chǎn)及產(chǎn)酸的最適溫度為27.5℃，低于此溫度時(shí)菌體長勢較差，且產(chǎn)酸水平較低。高于30℃后，菌體生長受到顯著抑制，產(chǎn)酸水平也發(fā)生明顯下降，當(dāng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，由于部分菌體受熱裂解，且有機(jī)酸揮發(fā)速率增加等因素，導(dǎo)致培養(yǎng)基中醋酸含量隨培養(yǎng)時(shí)間增加而略呈下降趨勢(圖3B),證實(shí)該菌株的最適生長溫度為27.5 ℃。

2.5.3不同碳氮源對菌株產(chǎn)酸的影響 設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)分別以不同碳源、氮源組合制備培養(yǎng)基，并在相同條件下培養(yǎng)，測定不同碳氮源配比在不同培養(yǎng)時(shí)間里對菌株產(chǎn)酸的影響。結(jié)果如圖4所示，表明在培養(yǎng)條件相同的情況下，以蔗糖為碳源，酵母粉為氮源，對提高醋酸產(chǎn)量最為有利，碳源更換為糖蜜產(chǎn)醋酸量次之。但由于糖蜜屬于制糖工業(yè)副產(chǎn)品，價(jià)廉易得，因此更適合于作為微生物培養(yǎng)基。

3 討論

近些年，隨著消費(fèi)者健康意識的不斷提高，具有保健功能的食品逐漸暢銷，相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)力度也不斷加強(qiáng)，果醋作為一類保健型飲品，其研究生產(chǎn)也受到廣泛重視，但國內(nèi)相關(guān)研究多集中于果醋釀造原材料種類的開發(fā)以及釀造工藝的優(yōu)化[24-25]，而對于新釀造菌種的篩選鑒定及培育相對缺乏。醋酸菌作為食醋釀造及醋酸發(fā)酵過程中的主導(dǎo)微生物，醋酸菌的種類對于其發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)的優(yōu)劣往往具有決定性作用。本研究自中國西北地區(qū)生產(chǎn)番茄表面分離純化產(chǎn)醋酸菌，并對其種類進(jìn)行生理生化及16S rRNA編碼基因序列分類鑒定，獲得一株具有較強(qiáng)醋酸生產(chǎn)能力并可在番茄表面環(huán)境生長的醋酸桿菌。此外，通過對其培養(yǎng)條件進(jìn)行碳氮源、溶氧及溫度等的優(yōu)化，提高單位培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)醋酸菌的生長密度及醋酸產(chǎn)量，結(jié)果證實(shí)當(dāng)以搖瓶方式對該菌進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其最適生長溫度為27.5 ℃，且在搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r·min-1時(shí)達(dá)到最高生長濃度。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在常見碳氮源中，菌株在含有蔗糖和酵母粉的培養(yǎng)基中達(dá)到最高產(chǎn)酸水平，以制糖業(yè)副產(chǎn)物糖蜜為碳源對該菌進(jìn)行培養(yǎng)也可獲得較高醋酸產(chǎn)量。經(jīng)過條件優(yōu)化后，菌株BQ-1的醋酸生產(chǎn)量最高可達(dá)到18.23 g·L-1，基本滿足果醋的生產(chǎn)要求。由于該醋酸菌在番茄表面具有較強(qiáng)生長能力，因此，通過進(jìn)一步研究開發(fā)，該菌株有望用于高品質(zhì)番茄果醋的釀造生產(chǎn)。此外，后期可通過基因工程手段在該菌株中過表達(dá)與醋酸生產(chǎn)相關(guān)的乙醇脫氫酶及乙醛脫氫酶，有望進(jìn)一步提高該菌株的產(chǎn)醋酸能力，從而增強(qiáng)其應(yīng)用價(jià)值。

A：不同溶氧條件(以培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速控制調(diào)節(jié))對BQ-1產(chǎn)醋酸量的影響；B：不同培養(yǎng)溫度對菌株BQ-1產(chǎn)醋酸量的影響圖3 不同培養(yǎng)條件對BQ-1產(chǎn)醋酸量的影響Fig.3 Effect of acetic acid production of BQ-1 under different conditions

圖4 不同碳氮源組合在不同時(shí)間內(nèi)對菌株BQ-1產(chǎn)醋酸量的影響Fig.4 Affection of acetic acid production of BQ-1 under different carbon and nitrogen source combination