低分子肝素鈉創(chuàng)面下注射對(duì)深二度燒傷創(chuàng)面早期進(jìn)行性損害的影響

陳賓，況芳，李桂強(qiáng)，趙婧楠，蔣航，黃益凡，李孝建(通訊作者*)

(1.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院燒傷整形科，廣東 廣州；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州)

0 引言

燒傷創(chuàng)面早期進(jìn)行性損害是臨床普遍存在的現(xiàn)象，特別是深二度創(chuàng)面，一旦發(fā)生，可使殘存的真皮組織及皮膚附件遭到進(jìn)一步破壞，形成三度創(chuàng)面，同時(shí)損傷范圍向鄰近正常組織擴(kuò)展，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。創(chuàng)面局部過(guò)度炎癥反應(yīng)和血栓形成被認(rèn)為是燒傷創(chuàng)面早期發(fā)生進(jìn)行性損害的重要原因。低分子肝素鈉是臨床常用的抗凝藥物，近年來(lái)，其抗炎特性越來(lái)越得到廣大研究者的關(guān)注。本研究擬通過(guò)創(chuàng)面下注射低分子肝素鈉來(lái)觀察其對(duì)燒傷創(chuàng)面早期進(jìn)行性損害的影響并初步探討其相關(guān)機(jī)制，為臨床防止燒傷創(chuàng)面早期加深提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 大鼠深二度梳狀燙傷動(dòng)物模型建立

40只雄性SD大鼠(180-220g)，制作模型前適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，術(shù)前禁食12小時(shí)。稱重后腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(40mg/kg)麻醉大鼠。電動(dòng)剃毛刀剃毛后脫毛劑脫毛。建模前先用恒溫水浴鍋將水加熱至80℃并保持恒溫，將黃銅梳狀燙傷模具放入熱水中加熱15秒，然后，用燙傷模具分別于大鼠兩側(cè)背部持續(xù)燙傷8秒(模具無(wú)附加壓力接觸皮膚)建立深二度燙傷創(chuàng)面，經(jīng)病理組織檢查證實(shí)為深二度創(chuàng)面。一側(cè)背部形成四個(gè)1cm×2cm大小矩形創(chuàng)面，兩個(gè)創(chuàng)面之間形成一個(gè)0.5cm×2cm大小矩形正常皮膚。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組、時(shí)相點(diǎn)設(shè)置及創(chuàng)面處理

大鼠隨機(jī)分為燙傷對(duì)照組和燙傷+低分子肝素鈉干預(yù)組，每組各 20只。設(shè)置傷后 6h、12h、24h、48h和 72h共 5個(gè)觀察時(shí)相點(diǎn)，每組每個(gè)時(shí)相點(diǎn)4只大鼠。燙傷對(duì)照組每個(gè)創(chuàng)面下注射0.5mL生理鹽水，燙傷+低分子肝素鈉干預(yù)組每個(gè)創(chuàng)面下注射0.5mL 5000IU/mL的低分子肝素鈉生理鹽水溶液。

1.3 標(biāo)本采集

大鼠麻醉后，經(jīng)頸椎脫臼處死。用手術(shù)剪剪下背部創(chuàng)面及瘀滯區(qū)皮膚，同時(shí)清除皮下肉膜。組織標(biāo)本先用0.9%NS洗凈，用于制作石蠟切片的標(biāo)本用10%福爾馬林溶液固定，而其余組織標(biāo)本則放置于標(biāo)本凍存盒中液氮中凍存以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

1.4 創(chuàng)面組織石蠟切片制作及形態(tài)學(xué)觀察

將10%福爾馬林溶液固定皮膚組織標(biāo)本制成石蠟切片。石蠟切片經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色及Masson染色，分別觀察表皮、真皮及皮膚附件情況，創(chuàng)面炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況和血管栓塞情況。

1.5 創(chuàng)面深度測(cè)量

Masson染色中紅色代表組織壞死，研究中可以通過(guò)測(cè)量切片中瘀滯區(qū)組織兩個(gè)邊緣及中心的組織損傷深度，最后得出一個(gè)平均深度。

1.6 創(chuàng)面組織炎癥因子及MPO含量測(cè)定

本部分實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒及TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒(均為美國(guó)Raybiotech公司生產(chǎn))來(lái)檢測(cè)瘀滯區(qū)組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6等的含量。應(yīng)用美國(guó)Abcam 公司生產(chǎn)的MPO ELISA試劑盒檢測(cè)組織中MPO含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用美國(guó)IBM公司的SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果主要以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)形式表示，組間比較，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠深二度燙傷動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用國(guó)內(nèi)外廣泛用于研究燒傷創(chuàng)面早期進(jìn)行性損害的黃銅梳狀模具通過(guò)熱接觸的形式建立深二度燙傷動(dòng)物模型(見(jiàn)圖1a)。于每只大鼠背部?jī)蓚?cè)分別建立4個(gè)1cm×2cm大小燙傷創(chuàng)面，每側(cè)背部燙傷創(chuàng)面之間共形成3條0.5cm×2cm大小瘀滯帶(見(jiàn)圖1b)。留取燙傷創(chuàng)面組織標(biāo)本行病理學(xué)檢查，證實(shí)為深二度燙傷(見(jiàn)圖1c，1d)。

2.2 創(chuàng)面炎癥浸潤(rùn)情況(HE染色)和壞死深度(Masson染色)觀察與比較

創(chuàng)面及瘀滯區(qū)組織切片HE染色顯示，燙傷對(duì)照組局部殘留的毛囊、汗腺等皮膚附件結(jié)構(gòu)明顯減少，組織明顯充血水腫，部分膠原纖維變性、斷裂，壞死組織與正常組織交界處可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)而成的一條炎癥帶。燙傷+低分子肝素鈉干預(yù)組皮膚殘留的皮膚附件較燙傷對(duì)照組數(shù)量明顯增多，結(jié)構(gòu)完整；組織發(fā)生充血、水腫和創(chuàng)面及瘀滯區(qū)組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕。Masson染色見(jiàn)燙傷+低分子肝素鈉干預(yù)組紅色染色區(qū)域范圍及深度明顯小于燙傷干預(yù)組。通過(guò)定量分析測(cè)量損傷深度見(jiàn)從傷后12小時(shí)起，燙傷對(duì)照組瘀滯區(qū)損傷平均深度明顯深于燙傷+低分子肝素鈉干預(yù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

2.3 瘀滯區(qū)組織IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子及MPO含量測(cè)定

通過(guò)ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)燙傷后各時(shí)間點(diǎn)瘀滯區(qū)組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及髓過(guò)氧化物酶MPO的含量變化。研究發(fā)現(xiàn)，燙傷對(duì)照組與燙傷+低分子肝素鈉干預(yù)組大鼠瘀滯區(qū)組織在傷后各時(shí)間點(diǎn)炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α以及MPO均大量表達(dá)及釋放。燙傷+低分子肝素鈉干預(yù)組創(chuàng)面IL-1β含量與燙傷對(duì)照組比較，傷后12h兩組間比較差異即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)，而傷后24h、48h及72h兩組間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；IL-6兩組間比較，傷后6h、12h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，傷后24h、48h及72h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TNF-α含量?jī)山M間比較，傷后 6h、12h 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，傷后 24h、48h及72h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MPO含量?jī)山M間比較，傷后6h、12h及72h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，傷后24h及48h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。

圖1 a：黃銅梳狀燙傷模具圖1b：于大鼠一側(cè)背部建立4條矩形燙傷創(chuàng)面，創(chuàng)面之間為3條瘀滯帶圖1c：創(chuàng)面組織HE染色圖1d 創(chuàng)面組織Masson染色，紅色代表組織壞死區(qū)域。

3 討論

燒傷創(chuàng)面早期進(jìn)行性損害現(xiàn)象最常見(jiàn)于深二度創(chuàng)面，因而深二度創(chuàng)面也一直是臨床研究的重點(diǎn)[1,2]。目前國(guó)內(nèi)外主要選擇熱接觸方式制作深二度創(chuàng)面，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于研究燒傷創(chuàng)面早期進(jìn)行性損害機(jī)理研究的動(dòng)物模型主要有兩種[3,4]：大鼠梳狀燙傷動(dòng)物模型和大鼠大面積燙傷動(dòng)物模型(TBSA≥30%)。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠梳狀燙傷動(dòng)物模型，主要為了減少大面積燒傷后循環(huán)因素對(duì)局部創(chuàng)面的影響。通過(guò)黃銅梳狀模具在80℃熱水中浸泡8秒，之后與創(chuàng)面無(wú)壓力接觸10秒后形成燙傷創(chuàng)面，創(chuàng)面標(biāo)本行病理檢查證實(shí)為深二度創(chuàng)面。兩個(gè)燙傷創(chuàng)面之間的區(qū)域即本實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)瘀滯區(qū)。本動(dòng)物在我們的研究中也證實(shí)操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，比較適合用于研究深二度燒傷創(chuàng)面早期進(jìn)行性損害的發(fā)生機(jī)理。

表1 大鼠皮膚組織壞死深度(um，±SD)

表1 大鼠皮膚組織壞死深度(um，±SD)

注 *P＜0.05，** P＜0.01。

組別 傷后6h 傷后12h 傷后24h 傷后48h 傷后72h燙傷對(duì)照組 232.08±18.17 260.25±14.82 308±15.36 367±20.24 401.5±19.47燙傷+低分子肝素鈉干預(yù)組 228.42±20.64 246.58±10.55* 274±13.89** 311.25±20.87** 345.67±21.47**

既往的研究發(fā)現(xiàn)，燒傷創(chuàng)面早期進(jìn)行性損害現(xiàn)象往往發(fā)生于傷后72h內(nèi)，早在傷后3小時(shí)即可發(fā)生，傷后6小時(shí)即可肉眼觀察到瘀滯區(qū)變化并持續(xù)到48h至72h[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)將觀察點(diǎn)設(shè)置為傷后6h、12h、24h、48h及72h 5個(gè)點(diǎn)。我們的研究中亦發(fā)現(xiàn)，皮膚深燙傷6小時(shí)后，燙傷對(duì)照組大鼠瘀滯區(qū)皮膚部分即開(kāi)始變成暗棕褐色或黑色，隨著時(shí)間推移，棕褐色及黑色區(qū)域逐漸擴(kuò)大，另外Masson染色也發(fā)現(xiàn)，組織損傷的深度和范圍也隨著時(shí)間推不斷加深、擴(kuò)大。傷后48h之后壞死區(qū)域進(jìn)展的速度明顯減緩，壞死面積逐漸趨于穩(wěn)定。應(yīng)用低分子肝素鈉干預(yù)后，瘀滯區(qū)皮膚在傷后6小時(shí)之后雖也可觀察到燙傷對(duì)照組變成棕褐色或黑色，隨著時(shí)間推移，暗紫色及黑色區(qū)域逐漸擴(kuò)大，壞死深度及不斷加深的現(xiàn)象。證實(shí)低分子肝素鈉能減輕燒傷創(chuàng)面早期發(fā)生進(jìn)行性損害。

表2 瘀滯區(qū)組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及MPO的含量

中性粒細(xì)胞在凝血和血栓形成過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用，研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)有效手段耗竭中性粒細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)性血栓形成過(guò)程遭到逆轉(zhuǎn)[6]。中性粒細(xì)胞是燒傷后已知的第一個(gè)浸潤(rùn)創(chuàng)面的炎癥細(xì)胞并在傷后持續(xù)數(shù)周[7]。髓過(guò)氧化物MPO是反映中性粒細(xì)胞活化及功能狀態(tài)的標(biāo)志，其水平及活性高低反映著中性粒細(xì)胞的功能和活性狀態(tài)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，傷后瘀滯區(qū)MPO含量顯著升高，我們通過(guò)應(yīng)用低分子肝素鈉干預(yù)后，MPO顯著降低，瘀滯區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及微血栓形成數(shù)量明顯減少。提示，低分子肝素鈉能減輕燒傷創(chuàng)面早期發(fā)生進(jìn)行性損害的機(jī)理可能與其減輕局部過(guò)度炎癥反應(yīng)及血栓形成密切相關(guān)。

近年來(lái)，隨著肝素的抗炎特性得到越來(lái)越多的研究證實(shí)[8,9]，其在預(yù)防燒傷創(chuàng)面早期進(jìn)行性損害方面也取得了較好的效果，然而，目前大部分研究還是以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為主，臨床結(jié)果并未取得預(yù)期效果，其使用的時(shí)機(jī)及劑量還有待于進(jìn)一步深入研究。