楊旭,王叢
(江蘇省南通市中醫(yī)院,江蘇 南通)
糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer,DFU)具有較為復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制,是周圍血管、神經(jīng)病變及感染等因素綜合作用的結(jié)果,其治療是臨床急需解決的重要難題之一。芪柏愈瘍油外用治療糖尿病足潰瘍,應(yīng)用此藥在臨床上對糖尿病足潰瘍患者進(jìn)行治療,總有效率達(dá)到88.2%,臨床治療中發(fā)現(xiàn)芪柏愈瘍油可以減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng),改善肉芽組織形態(tài),促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
近代研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)的延遲以及失調(diào)與糖尿病足潰瘍創(chuàng)面延遲愈合密切相關(guān)[1]。正常的炎癥反應(yīng)是在促炎信號的調(diào)節(jié)下,炎細(xì)胞有規(guī)律的募集,炎細(xì)胞發(fā)揮作用后能從創(chuàng)面及時(shí)有序的清除,從而終止炎癥反應(yīng),使修復(fù)過程順利過渡到增殖期。當(dāng)炎癥反應(yīng)異常時(shí),會(huì)出現(xiàn)炎細(xì)胞消退延遲,使修復(fù)停滯在炎癥期,影響創(chuàng)面正常修復(fù)的進(jìn)程,糖尿病足潰瘍創(chuàng)面就存在炎癥細(xì)胞過度浸潤、炎癥消退延遲的現(xiàn)象[2]。此次研究以芪柏愈瘍油為干預(yù)藥物,以糖尿病大鼠潰瘍模型為研究對象,采用免疫組化檢測方法,研究芪柏愈瘍油促進(jìn)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合的作用,進(jìn)一步明確芪柏愈瘍油對潰瘍創(chuàng)面的作用機(jī)制,為糖尿病足潰瘍的中醫(yī)外治療法提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)環(huán)境
SD雄性大鼠,8-10周齡,體重為150±20g,購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物飼養(yǎng)及無菌手術(shù)均在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通環(huán)境及設(shè)施(編號為GB14925-200 1)》,按照《黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》對動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)管理及實(shí)驗(yàn)操作。飼養(yǎng)溫度為21±2℃,相對濕度40-70%,室內(nèi)明暗交替各12小時(shí)。SD大鼠分籠喂養(yǎng),飼料與墊料均經(jīng)消毒處理,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,墊料每日更換一次,保持墊料干燥。飲用水經(jīng)煮沸后冷卻至室溫提供給動(dòng)物。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品
芪柏愈瘍油:中藥飲片由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供,黃芪、黃柏、大黃、白芷、赤芍、血竭等藥物按比例配伍,制成濃度為每1mL含生藥0.85g的黃色澄清液體,密封保存。
復(fù)方紫草油:由紫草、冰片、忍冬藤、白芷組成,輔料為麻油。性狀為紫紅色澄清液體,規(guī)格為30mL/瓶。武漢健民集團(tuán)葉開泰國藥(隨州)有限公司,國藥準(zhǔn)字Z20044385,產(chǎn)品批號171242。
1.2.1 糖尿病大鼠潰瘍模型的建立
(1)糖尿病大鼠模型的建立
雄性SD大鼠80只,隨機(jī)分為空白對照組(NC組)16只,糖尿病組(DM組)64只。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,于第2周注射STZ溶液,注射前所有SD大鼠需要禁食不禁水12h,造模當(dāng)日稱取所有大鼠體重,尾靜脈采血測定基礎(chǔ)血糖。按照65mg/kg的劑量對DM組大鼠一次性腹腔注射配制好的STZ溶液,建立糖尿病大鼠模型;對NC組大鼠腹腔注射等容積的0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。各組大鼠于注射STZ溶液1小時(shí)后自由進(jìn)食進(jìn)水,之后每日給予大鼠充足飲水和攝食,保持墊料干燥。注射STZ溶液后3天、5天、7天分別檢測大鼠尾靜脈隨機(jī)血糖,血糖值2次或2次以上≥16.7mmol/L,則判定糖尿病大鼠模型造模成功[3]。
(2)糖尿病大鼠潰瘍模型的建立
成功建立糖尿病大鼠模型2周后制作糖尿病大鼠潰瘍模型,造模前12小時(shí)所有大鼠禁食不禁水,造模前3小時(shí)禁水,按0.3mL/100g的劑量對所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉。將麻醉后的大鼠俯臥位放在固定板上,固定住四肢,剪毛備皮,背部正中偏左側(cè)做直徑為2.0cm ×2.0cm的圓形標(biāo)記,無菌條件下用剪刀剪去標(biāo)記處全層皮膚(深達(dá)肌肉),止血后用生理鹽水沖洗創(chuàng)面[4]。
1.2.2 分組
未注射STZ溶液的大鼠為空白對照組(NC組),將造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組(MG組),芪柏愈瘍油組(TG1組)、復(fù)方紫草油組(TG2組)。
1.2.3 給藥方法
(1)空白對照組(NC組)與模型組(MG組)給藥方法:碘伏消毒后,局部清創(chuàng),用生理鹽水完全浸漬后覆蓋創(chuàng)面,外用無菌敷貼纏繞包扎,每天換藥一次。
(2)芪柏愈瘍油組(TG1組)給藥方法:碘伏消毒,局部清創(chuàng)后,用生理鹽水潤洗創(chuàng)面,將含有芪柏愈瘍油藥液的紗布濕敷于大鼠創(chuàng)面,外用無菌敷貼纏繞包扎,每天換藥一次。
(3)復(fù)方紫草油組(TG2組)給藥方法:碘伏消毒,局部清創(chuàng)后,用生理鹽水潤洗創(chuàng)面,將含有紫草油藥液的紗布濕敷于大鼠創(chuàng)面,外用無菌敷貼纏繞包扎,每天換藥一次。
圖1 IL-1β免疫組化染色結(jié)果(200×)
1.2.4 取材
在用藥后7、14天,將大鼠麻醉后,剪取大鼠創(chuàng)面組織(包括創(chuàng)面周圍正常皮膚組織),將組織置于無菌細(xì)胞凍存管中,于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80 0C冰箱中保存,用于免疫組化檢測。
1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間方差齊采用LSD法,方差不齊采用Tamhane's T2(M)法,以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪圖采用Graphpad 7.0軟件。
用藥后7、14天,與空白對照組(NC組)大鼠相比,糖尿病各組(MG組、TG1組和TG2組)大鼠創(chuàng)面組織中IL-1β表達(dá)水平明顯增加(P<0.05),芪柏愈瘍油組(TG1組)與復(fù)方紫草油組(TG2組)大鼠創(chuàng)面組織中IL-1β表達(dá)水平明顯低于MG組(P<0.05),TG1組和TG2組未見明顯差異。見圖1、2。
圖2 IL-1β陽性目標(biāo)面密度值比較
研究表明在糖尿病足潰瘍創(chuàng)面中IL-1β處于持續(xù)高表達(dá)的狀態(tài),導(dǎo)致創(chuàng)面炎癥反應(yīng)異常[5,6],是已知的最強(qiáng)的促炎細(xì)胞因子之一。IL-1β與其I型受體結(jié)合后,不但能增加自身的表達(dá),形成自我放大的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),還能夠促進(jìn)多種靶蛋白的磷酸化,促使NF-κB入核,增強(qiáng)促炎因子的表達(dá),使炎癥細(xì)胞浸潤異常增多,放大炎癥反應(yīng),并且持續(xù)較長時(shí)間,損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,使創(chuàng)面修復(fù)停滯不前,阻斷IL-1β被明,創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的吸收與消散明顯加快,順利過渡到增殖期,從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[8]。
此次研究中發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面組織中出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤增加,消退延遲的病理現(xiàn)象,經(jīng)檢測創(chuàng)面組織發(fā)現(xiàn)IL-1β等炎性細(xì)胞因子異常分泌。模型組(MG組)大鼠潰瘍創(chuàng)面在7天時(shí)炎癥反應(yīng)最重,14天時(shí)仍存在較多炎性細(xì)胞,出現(xiàn)炎癥反應(yīng)消退延遲的現(xiàn)象。用藥后,芪柏愈瘍油組(TG1組)與復(fù)方紫草油組(TG2組)大鼠創(chuàng)面組織中IL-1β的表達(dá)水平較模型組明顯降低,在藥物干預(yù)后的7天到14天炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平不斷降低,炎癥反應(yīng)逐漸消退,使創(chuàng)面微環(huán)境得到改善,從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。