外泌體中miRNAs 調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機制研究進(jìn)展*

李耀璽 段莉 王繼鋒 王大平*

[關(guān)鍵字] 骨肉瘤；miRNAs；外泌體

骨肉瘤作為主要影響兒童和青少年的惡性骨腫瘤，其治療一直是臨床中的難點。三十多年來，骨肉瘤治療方法主要為手術(shù)聯(lián)合新輔助化療，而骨肉瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，特別是肺轉(zhuǎn)移，其遠(yuǎn)期生存率不足30%[1]，因此抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移是降低骨肉瘤患者死亡率的重點。近年來，關(guān)于外泌體的研究日益增多，外泌體因其所含的豐富的生物活性物質(zhì)，為人們調(diào)節(jié)腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移帶來新的希望。根據(jù)ExoCarta 數(shù)據(jù)庫顯示，科學(xué)家們已在不同種細(xì)胞來源的外泌體中發(fā)現(xiàn)了超過7 500 種RNA[2]。其中miRNA 作為外泌體的重要成分之一，已被證實在多種腫瘤中異常表達(dá)，這也為調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性、早期診斷、臨床腫瘤負(fù)荷的預(yù)測提供了一個新的思路。

1 外泌體的結(jié)構(gòu)與功能

外泌體是指一種直徑40 ～100 nm 的小囊泡，絕大部分細(xì)胞都可以產(chǎn)生外泌體，外泌體在不同體液中可以自由循環(huán)，其主要作用是通過將信息（如蛋白、RNA、DNA）轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，從而介導(dǎo)特定的細(xì)胞間通訊。在電子顯微鏡下，外泌體表現(xiàn)為由雙層磷脂分子包裹，形態(tài)呈扁形或球形小體，還有些形態(tài)為杯狀；其在體液中的存在形式以球形結(jié)構(gòu)為主，通?？稍谡崽敲芏忍荻热芤褐忻芏葹?.13 ～1.19 g/mL時獲得富集[3]。

腫瘤源性外泌體最早于1981 年由Trams 等[4]發(fā)現(xiàn)并闡述，因其具有生物活性而進(jìn)入科學(xué)家們的視野，研究者們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以分泌比正常細(xì)胞更多的外泌體，而且腫瘤細(xì)胞所分泌的外泌體中具有更多的miRNA（即MicroRNA，是一種長18 ～25 個核苷酸的非編碼序列）。腫瘤來源的外泌體其內(nèi)容物具有高度的可變性并且依賴于細(xì)胞來源，但是無論其來源如何，腫瘤來源的外泌體對于受體細(xì)胞來說都具有很強的功能性，其對于調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性主要表現(xiàn)在3個方面:腫瘤細(xì)胞通過分泌外泌體，直接引發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移[5];腫瘤源性外泌體以miRNA 為媒介，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境[6];腫瘤源性外泌體通過改造遠(yuǎn)處的間質(zhì)細(xì)胞，間接促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，如富含TGF- 1 蛋白的腫瘤源性外泌體可以促進(jìn)靜息狀態(tài)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，同時還可以促進(jìn)新生血管的形成，間接促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移[7]。目前令人欣喜的是近年來在乳腺癌的研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)可通過外泌體在不同轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞之間傳遞miRNA，從而達(dá)到改變腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的效果[8]。最近亦有研究表明，可采取調(diào)節(jié)miRNA 表達(dá)的方法，通過外泌體介導(dǎo)的特異性細(xì)胞間通訊，從而影響骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

2 miRNAs 從細(xì)胞分選至外泌體的相關(guān)機制研究

外泌體成分復(fù)雜，包含了多種生物信息，因其中的miRNA 具有基因表達(dá)效應(yīng)，故而受到最大的關(guān)注。Goldie 等[9]針對神經(jīng)突觸的研究指出，外泌體中的miRNA 濃度甚至高于分泌其的細(xì)胞本身，miRNA 是通過細(xì)胞內(nèi)定位的動態(tài)模式傳遞或產(chǎn)生的，其分泌至外泌體的機制可能存在著翻譯以外的動態(tài)組合機制。Guduric-Fuchs 等[10]分析了HEK293T（人胚胎腎上皮細(xì)胞）、HMEC-1（人微血管內(nèi)皮細(xì)胞）等多種細(xì)胞及其分泌的外泌體，發(fā)現(xiàn)miRNA 的子集（如miRNA-150、miRNA-451、miRNA-142-3p 等）會優(yōu)先進(jìn)入外泌體，其中又以miRNA-451 富集程度最高。根據(jù)目前的研究，miRNA 分選進(jìn)入外泌體可能存在3 種途徑:神經(jīng)鞘磷脂酶2（nSMase2）依賴性途徑，nSMase2 是與miRNA 分泌到外泌體有關(guān)的第一個分子，Kosaka 等[11]發(fā)現(xiàn)nSMase2 的過表達(dá)會增加外泌體中miRNA 的量，而一旦nSMase2 受到抑制，外泌體中miRNA 就會相應(yīng)的減少。miRNA 3'末端的序列依賴性途徑，Koppers-Lalic 等[12]發(fā)現(xiàn)從B 細(xì)胞及尿液來源的外泌體大多含有內(nèi)源性的miRNA 尿嘧啶核苷酸的3'末端，而B 細(xì)胞來源的外泌體還大多含有內(nèi)源性miRNA腺嘌呤核苷酸的3'末端。這說明了miRNA 的3'末端可能含有了關(guān)鍵的分選信號。miRNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合（miRISC）途徑，眾所周知，成熟的miRNA 可以與裝配蛋白相互作用形成一種稱為miRISC 的復(fù)合物。miRISC 主要包括miRNA、AGO2、可被miRNA 抑制的mRNA，AGO2 是一種傾向于結(jié)合在miRNA5'末端的尿嘧啶核苷酸或者腺嘌呤核苷酸的蛋白質(zhì)[13]，其主要作用一是在mRNA 形成miRNA 這一過程中起調(diào)節(jié)作用，二是抑制或者降解mRNA 分子。最近的研究認(rèn)識到AGO2 與外泌體中miRNA 的分選存在相關(guān)性，Guduric-Fuchs 等[10]發(fā)現(xiàn)在敲除AGO2 后，那些優(yōu)先裝配到外泌體中的miRNA（如miRNA-150、miRNA-451、miRNA-142-3p）會明顯減少。由此可見，某些miRNA 中存在的特異性序列可以引導(dǎo)一些miRNA 進(jìn)入外泌體，而一些蛋白質(zhì)也可能參與了miRNA 的分選。

3 外泌體中的miRNAs 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用

值得一提的是，Shimbo 等[14]對于骨肉瘤細(xì)胞的研究很好提示了miRNA-143 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移性發(fā)面的遠(yuǎn)大前景，他們通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的方法將miRNA-143 轉(zhuǎn)染入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），同時引起了細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)的miRNA-143增加，通過波譜分析可知細(xì)胞外的miRNA-143 都位于外泌體中，之后將miRNA-143 以外泌體的形式用于培養(yǎng)143B 細(xì)胞，通過細(xì)胞增殖及細(xì)胞遷移實驗觀察到，該種細(xì)胞的遷移性較實驗前得到了很好的抑制。此外還有幾項與miRNA-143有關(guān)的實驗，有研究者通過構(gòu)建小鼠骨肉瘤模型，將143B細(xì)胞接種于小鼠，同時將miRNA-143 轉(zhuǎn)染進(jìn)143B 細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤的肺部轉(zhuǎn)移得到了很好的抑制，同時還發(fā)現(xiàn)MMP-13（即金屬基質(zhì)蛋白酶-13，是一種蛋白水解酶）是miRNA-143 在這些靶基因中下調(diào)最明顯的蛋白質(zhì)，在臨床樣品中，所有的肺轉(zhuǎn)移陽性病例中均觀察到MMP-13 中等陽性或強陽性。這些數(shù)據(jù)表明，miRNA-143 的下調(diào)導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞中MMP-13 表達(dá)的上調(diào)，并促進(jìn)了原發(fā)病灶的肺轉(zhuǎn)移[15]；因此，將miRNA-143 模擬物遞送到腫瘤細(xì)胞中可通過至少抑制MMP-13 表達(dá)來防止骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)。Li 等[16]針對miRNA-143 與TGF- 1 信號通路的關(guān)系展開研究，他們分析了60 例骨肉瘤組織與鄰近周圍組織，發(fā)現(xiàn)TGF- 1 信號通路可以抑制miRNA-143，從而上調(diào)多功能蛋白（Versican，一種來自成纖維細(xì)胞的蛋白聚糖）的表達(dá)，借而影響骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Wang 等[17]針對癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）的研究證明了多種miRNA 對骨肉瘤轉(zhuǎn)移性的影響。在此項研究中，科學(xué)家們使用miRNA 微陣列分析，鑒定了13 種miRNA，這些miRNA 在源自癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）和相應(yīng)的癌癥成纖維細(xì)胞（PAF）的外泌體中且表達(dá)顯著增加。體外研究進(jìn)一步驗證了miRNA-1228 的水平在CAFs 分泌的外泌體和骨肉瘤細(xì)胞中增加，其可以下調(diào)骨肉瘤中的內(nèi)源性SCAI（癌細(xì)胞侵襲抑制因子）水平。此外，此項研究提供證據(jù)表明CAFs 外泌體來源的miR-1228 能夠通過靶向SCAI 促進(jìn)骨肉瘤的侵襲和遷移。

Tsai 等[18]研究了CTGF（結(jié)締組織生長因子）調(diào)節(jié)miRNA-519d 而影響骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性，CTGF 過度表達(dá)時，miRNA-519d 下調(diào)十分明顯。之后研究者們使用qRT-PCR證實了這點。他們將MG-63 細(xì)胞和U-2 OS 細(xì)胞與rCTGF（5 ～50 ng/mL）溫育24 h，通過qRT-PCR 檢查miR-519d表達(dá)情況。用miR-519d 模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h，并通過Transwell 測定檢查細(xì)胞遷移。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTGF 過度表達(dá)確實可以通過下調(diào)miRNA-519d 抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。更令人矚目的是，作者通過小鼠構(gòu)建了動物模型，6 周后處死小鼠并取肺組織活檢，進(jìn)一步驗證了結(jié)論。由此可見，miRNA不僅可以通過信號通路影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，更可以直接通過細(xì)胞因子傳遞生物信息。

和以上研究不同的是，Gong 等[19]采用相似的研究方法驗證了同類細(xì)胞外泌體中的miRNA 也可以傳遞生物信息，首先他們利用慢病毒在高轉(zhuǎn)移性的Hos 骨肉瘤細(xì)胞中過表達(dá)miRNA-675，之后利用外泌體中的miRNA-675 調(diào)控非轉(zhuǎn)移性的成骨細(xì)胞hFOB 1.19，通過Transwell 實驗及劃痕實驗驗證其轉(zhuǎn)移性前后的變化，發(fā)現(xiàn)hFOB 1.19 的轉(zhuǎn)移和侵襲能力得到了提升，miRNA-675 可下調(diào)下游基因CALN1 的表達(dá)，同時證明了在上調(diào)的miRNA-675 和下調(diào)的CALN1 與骨肉瘤患者的肺轉(zhuǎn)移有關(guān)。雖然納入該項實驗的患者數(shù)量只有8 人，但考慮到骨肉瘤的發(fā)病率，依然有著很強的說服力。

4 外泌體中miRNAs 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移診斷及治療中的應(yīng)用

骨肉瘤的早期診斷、早期規(guī)范治療一直是臨床醫(yī)生的目標(biāo)，近5 年來外泌體的研究證明，miRNAs 有望成為骨肉瘤早期診斷的新希望。而血液中的RNA 極不穩(wěn)定且容易降解，這使我們難以檢測循環(huán)中相關(guān)的miRNA 含量，但是由于外泌體膜的保護(hù)，使得外泌體中的miRNA 相對穩(wěn)定，也為miRNA 的診斷用于臨床增加了信心。目前研究顯示，血清中的miRNA 作為腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)在結(jié)腸癌（miRNA-22[20]、miRNA-143[21]）及乳腺癌（miRNA-10b[22]）的診療中取得了進(jìn)展。隨著外泌體純化技術(shù)的進(jìn)步，富集外泌體的方法也變得多種多樣，其主要包括超速離心法、密度梯度分離法、免疫捕獲效應(yīng)等方法，其純化的手段不同，外泌體內(nèi)容物含量也會有所不同。Fujiwara 等[23]通過檢測骨肉瘤患者血清，發(fā)現(xiàn)236 種miRNA 高于正常人，其中又發(fā)現(xiàn)miRNA-17-5p 及miRNA-25-3p 同時在骨肉瘤細(xì)胞及骨肉瘤細(xì)胞分泌的外泌體中表達(dá)上調(diào)，而miRNA-25-3p 上調(diào)最為明顯，更進(jìn)一步證明了血清中miRNA-25-3p 的水平與患者的預(yù)后和腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)，此種miRNA 可能成為腫瘤檢測及患者預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。

一項涉及48 例骨肉瘤患者的研究指出，外泌體中的miRNA 還具有著評估患者對化療反應(yīng)的作用，Xu 等[24]針對患者的血液，使用高速離心法提純外泌體后，每個獨立樣本進(jìn)行RNA 的陣列表達(dá)，他們研究分析了多種外泌體中的miRNA 指出:外泌體中的miRNA 在預(yù)測化療反應(yīng)差的患者的預(yù)后時具有臨床意義，同時miRNA-148a、miRNA-133、miRNA-27a等8 種miRNA有望成為化療反應(yīng)差的骨肉瘤患者的生物標(biāo)志物。不同種類的miRNA 調(diào)節(jié)骨肉瘤轉(zhuǎn)移性的研究已經(jīng)非常豐富，但外泌體作為一個新興的研究熱點，其不僅為人為調(diào)控miRNA、影響骨肉瘤的轉(zhuǎn)移性提供了新的平臺，更有可能應(yīng)用于臨床，評估骨肉瘤患者的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。

5 展望

外泌體作為一個新興的研究熱點，給miRNA 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移提供了一個新的可操作性平臺，雖然迄今為止骨肉瘤的轉(zhuǎn)移在臨床上是一個治療難點，但通過上調(diào)或下調(diào)外泌體中的miRNA 可為干預(yù)骨肉瘤轉(zhuǎn)移提供新的希望。