高壓干熱處理對紫蘇粉的滅菌作用和促成分溶出作用*

咩咩此里，阿 茸，李 月，殷 華，段金連，段為鋼△

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省中醫(yī)藥學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，云南 昆明 650500；2.迪慶州藏醫(yī)醫(yī)院制劑室，云南 香格里拉 674400）

熱處理是制藥和食品工藝中常見操作，多用于滅菌和炮制[1-9]。物品消毒滅菌的方法很多，總體上分為物理法和化學(xué)法。制藥工藝常采用物理法進行消毒滅菌。對于制劑成品，可靠的消毒滅菌方式是高壓濕熱滅菌和輻照滅菌[1]。輻照滅菌所需的硬件設(shè)施要求較高，一般建立在較發(fā)達城市，不方便較偏遠(yuǎn)的制藥企業(yè)或醫(yī)院使用。高壓濕熱滅菌對硬件設(shè)施要求較低，滅菌也很徹底，但滅菌過程涉及到水蒸氣加熱，可能會使滅菌物潮化，繼而需要烘干等操作，不適用于不耐濕物料。干熱滅菌可以避免滅菌物潮化的問題，但目前采用的都是常壓干熱處理[4，7]，因溫度高（135℃以上）、時間長（180～200℃要0.5～1 h，135～140℃要3～5 h），滅菌后物料失重明顯，對物料的性狀影響較大，在制藥工藝鮮有應(yīng)用。

本研究試圖結(jié)合高壓濕熱滅菌和常壓干熱滅菌的優(yōu)點，開發(fā)一種高壓干熱滅菌技術(shù)，在檢驗滅菌效果的同時也考察其對中藥材（粉末）溶出的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥紫蘇 （Perilla frutescens（L.）Brltt.var.arguta Benth.Hand.-Mazz.）為野生，產(chǎn)自湖南，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室鑒定。全自動高壓蒸汽滅菌器和干熱滅菌器為日本天美產(chǎn)品，透紫外平底96孔板為Greiner產(chǎn)品，Tecan多功能酶標(biāo)儀（Infinity 200pro）為奧地利產(chǎn)品。

1.2 藥材加熱處理 將紫蘇梗干燥粉碎過40目篩。精密稱取17份0.4 g紫蘇粉分別裝于容積為15 mL的帶蓋耐壓塑料試管中。其中一管為對照，不進行加熱處理（標(biāo)記為加熱0 min）；其余以4管為一組，共4組。第1組開蓋置于高壓蒸汽滅菌器中（高壓濕熱），第2組蓋緊后置于高壓蒸汽滅菌器中（高壓干熱），第3組蓋緊置于干熱滅菌器中（常壓密閉干熱），第4組開蓋置于干熱滅菌器中（常壓開放干熱），分別于 110 ℃（0.143 MPa）加熱 15、30、60、120 min。加熱時間以達到溫度開始計算，熱處理完畢自然降溫到60℃后擰緊試管蓋取出恢復(fù)至室溫。精密稱量滅菌前后藥粉的重量變化。

另取17份0.4 g紫蘇粉如法在 121℃（0.204 MPa）進行加熱。以上實驗各重復(fù)3次。

1.3 藥材無菌檢查 在各試管內(nèi)加入5 mL無菌蒸餾水，蓋緊蓋子平放于旋轉(zhuǎn)搖床上100 r/min振搖6 h。于4℃靜置2 h以上，取上清0.5 mL在無菌操作條件下涂布于滅菌LB瓊脂平板（蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂10 g，121℃高壓滅菌30 min后制得）上，于37℃培養(yǎng)過夜。觀察LB固體培養(yǎng)基上的菌落生長情況，拍照記錄。

1.4 藥材溶出物檢查 將試管于3 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL加入到透紫外的96孔板中，用酶標(biāo)儀掃描230～800 nm吸收曲線，2 nm步進。如果波長范圍內(nèi)最大吸收值超過2，加水稀釋1倍再掃描，記錄稀釋倍數(shù)。在扣除同等體積無菌水背景后，將OD值乘以稀釋倍數(shù)得到原液的原始吸收值。按照文獻方法求出等吸光點[10]，計算等吸光點前的吸收光譜曲線下面積以反映藥材的溶出物。

2 結(jié)果

2.1 紫蘇粉末高壓干熱前后的重量變化 高壓濕熱處理會導(dǎo)致中藥粉末吸潮，重量增加；而高壓干熱和常壓閉蓋處理藥粉的重量變化相對不明顯；常壓開蓋處理則藥粉的重量減輕最明顯。與110℃處理（圖1A）相比，121℃處理（圖1B）會進一步加劇重量變化，見圖1。

圖1 紫蘇粉110℃（0.143 MPa）熱處理（A）和121℃（0.204 MPa）熱處理（B）后的重量差異變化

2.2 高壓干熱處理對藥材微生物的影響 熱處理能抑制甚至殺滅微生物。未被熱處理的紫蘇粉浸出液上清（0 min）能培養(yǎng)出大量的細(xì)菌（圖2A、圖3A）；110℃高壓濕熱處理15 min及以上不能培養(yǎng)出細(xì)菌菌落（圖2A）；高壓干熱處理15 min可培養(yǎng)出個別菌落（圖2B），但處理30 min以上就不能培養(yǎng)出菌落；而常壓熱處理（圖2C、圖2D）滅菌效果較差。121℃熱處理的滅菌效果進一步增強，但常壓15 min處理（圖3C、圖3D）的樣品仍有個別菌落被檢出。以上結(jié)果說明，在相同溫度下，高壓處理（圖3A、圖3B）效果總體上優(yōu)于常壓處理（圖3C、圖3D），見圖 2、圖 3。

圖2 110℃（0.143 MPa）不同方式熱處理的滅菌效果

圖3 121℃（0.204 MPa）不同方式熱處理的滅菌效果

2.3 高壓干熱處理對藥材成分溶出的影響 不同方式熱處理后溶出物的吸收光譜參見圖4、圖5。紫蘇粉溶出物在370 nm處存在等吸光點，等吸光點前的紫外區(qū)（230～370 nm）吸收值（圖6）能在一定程度總體反映藥物分子的溶出情況。

圖4 110℃（0.143 MPa）對紫蘇粉成分溶出的影響（吸收曲線）

圖5 121℃（0.204 MPa）對紫蘇粉成分溶出的影響（吸收曲線）

圖6 110 ℃（0.143 MPa）（A）和 121 ℃（0.204 MPa）（B）不同方式對藥材小分子成分溶出的影響（吸收曲線下面積230～370 nm）

高壓110℃熱處理（圖4A、圖4B）藥材粉末15 min即可增加溶出物的紫外吸收，以高壓干熱方式（圖4B、圖6A）增加較明顯。此溫度下常壓熱處理15 min則幾乎無效，延長熱處理時間則可增加溶出物的紫外區(qū)吸收（圖4C、圖4D）。

當(dāng)進行121℃熱處理時，各種加熱方式均能增加溶出物紫外區(qū)的吸收（圖5），但常壓加熱（圖5C、圖5D）的紫外最大吸收值低于高壓加熱（圖5A、圖5B）的吸收值。特別地，高壓干熱處理（圖5B）15 min增加吸收值的能力即處在最大水平（圖6B）。

3 討論

由于缺乏高壓干熱處理裝置，本文將樣品置于密閉的試管內(nèi)進行濕熱處理實現(xiàn)近似的高壓干熱處理操作。從以上結(jié)果看，在同等溫度和同等加熱時間，高壓濕熱處理的滅菌效果最好，其次即為高壓干熱處理，而常壓熱處理的滅菌效果較差。因此，考慮到處理后不需要干燥的優(yōu)勢，高壓干熱處理仍是值得推薦的。理論上，高壓干熱處理后的樣品不應(yīng)該存在重量差異，本研究也證實高壓干熱處理的樣品重量變化最小。如果要進行滅菌操作，121℃ 15～30 min、110℃30～60 min的高壓干熱處理是值得推薦的。

紫蘇含有揮發(fā)油成分和黃酮類等固體物成分[11]，本研究還用該藥材粉末模擬熱處理對中藥成分溶出的影響。根據(jù)前期中藥注射劑的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大多中藥的“活性成分”均具有較明顯紫外吸收[10，12]，甚至等吸光點前的吸收曲線下面積能綜合反映活性成分的多少，因此本文采用該特性“綜合”考察了熱處理對中藥成分的溶出影響。未被熱處理的中藥溶出物紫外吸收值較小，而熱處理后的中藥溶出物紫外吸收明顯增加，甚至還依次在290 nm和330 nm出現(xiàn)了明顯的吸收峰；這表明熱處理有助于藥材成分的溶出，這可能與熱處理改變了植物細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)?？紤]到高壓干熱處理對藥材總體的重量影響較小，推測對藥材的性狀影響也較小。對于中藥紫蘇粉末而言，110℃15 min似乎就取得了較好的促藥材成分溶出作用，同時大大地降低了藥材的微生物載量，但對其他藥材的影響如何，仍需進行試驗。不管怎樣，該法在某些物料的處理中值得試用。

從機理上看，高壓熱處理阻止了熱量向外界擴散，有利于熱量在加熱體系內(nèi)傳遞，從而有利于生物大分子物質(zhì)發(fā)生變性、有利于殺菌、凝固藥材細(xì)胞并有利于活性成分釋放。高壓干熱處理的傳熱介質(zhì)是空氣，高壓濕熱處理的傳熱介質(zhì)是水蒸氣。由于水蒸氣存在汽化熱，在熱傳遞方面更加充分，因此高壓干熱處理的滅菌效果會略低于高壓濕熱滅菌。相反，常壓加熱，氣體會膨脹擴散到外界，熱量散失多而不利于熱量進入物體中，滅菌的效果會下降。

高壓濕熱和常壓干熱法在食品和藥品滅菌工藝中有著較廣泛的應(yīng)用[1]，也取得一定效果。但高壓干熱法卻罕見報道，本研究為物料的滅菌和中藥炮制提供了一種選擇。將藥材加熱121℃30 min或110℃30 min可能在增加溶出的同時會導(dǎo)致藥材成分變化?？紤]到水是化學(xué)反應(yīng)的重要介質(zhì)，因此可以肯定的是，該方法所致的藥物成分影響會弱于高壓濕熱滅菌?？紤]到該條件在藥物炮制過程中并不算劇烈，該方法也可以供中藥炮制參考。然而，更為緊要的是要研制此類設(shè)備，以滿足醫(yī)院和制藥企業(yè)的需求。