基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討清瘟解熱合劑治療新型冠狀病毒肺炎的作用機(jī)制*

朱波宇，楊 璐，王洪武，張翟軼，李 欽，崔換天，廖家抱，溫偉波△

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021；3.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省動(dòng)物細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；4.嘉興市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 嘉興 314033）

今年初，湖北省武漢市出現(xiàn)了由新型冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）。COVID-19 具有傳播迅速廣泛、傳染性強(qiáng)、各類人群普遍易感的特點(diǎn)，目前臨床尚無特效藥[1]。中醫(yī)藥作為我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥，在納入新型冠狀病毒肺炎診治方案后，取得了突出的療效。COVID-19在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)里屬于“疫病”的范疇，多為外邪侵入機(jī)體，體內(nèi)正氣不足導(dǎo)致。運(yùn)用中醫(yī)理論進(jìn)行辨證，病因?yàn)楦惺芤哽逯畾?，病位在肺，基本病機(jī)特點(diǎn)為“濕、熱、毒、瘀”[2-3]。

清瘟解熱合劑（Qingwen Jiere Mixture）是立足于中醫(yī)對“瘟疫”的防治理論而研制的中藥復(fù)方制劑。主要成分有：藿香、柴胡、黃芩、連翹、法半夏、草果、茵陳、馬蹄香、滑石、甘草、白薇、炒神曲、炒厚樸。藿香具有芳香化濕、和胃止嘔的功效；柴胡可以疏散退熱、升舉陽氣；黃芩和連翹能清熱、瀉火解毒；半夏可燥濕化痰、降逆止咳、消痞散結(jié)；草果能燥濕溫中、截瘧祛痰；茵陳可清利濕熱，利膽退黃；馬蹄香內(nèi)服消風(fēng)散氣解暑，利尿通淋去積；滑石為寒涼藥物，能清熱解暑，保護(hù)腸壁；甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒和調(diào)和諸藥的功效，在驅(qū)邪的同時(shí)又扶助正氣；白薇能清熱涼、利尿通淋；厚樸歸肺經(jīng)、脾經(jīng)，可以燥濕行氣、消痰平喘；神曲辛溫，歸脾胃經(jīng)，具有消食和胃的功效。本方配伍用藥具有清熱化濕，芳香避穢，燥濕止瀉等功效；對于治療COVID-19感染輕中癥、疑似患者及時(shí)疫感冒癥見發(fā)熱身痛，咽痛咳嗽，腹脹痞滿，大便黏膩臭穢或便溏腹瀉，納差乏力等具有顯著療效。在我國新冠肺炎疫情暴發(fā)時(shí)，清瘟解熱合劑用于云南省定點(diǎn)醫(yī)院及湖北省咸寧市部分受援單位，臨床療效顯著。清瘟解熱合劑用于老撾、緬甸等我國周邊國家及地區(qū)，同樣取得了良好的臨床療效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種常見的研究中藥復(fù)方作用機(jī)制的方法，從中醫(yī)的整體觀念出發(fā)，結(jié)合辨證論治的方法，多種學(xué)科交叉運(yùn)用，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，探求疾病和藥物的聯(lián)系[4]，為解釋中藥復(fù)雜作用機(jī)制提供了方法。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢索清瘟解熱合劑的活性成分和靶點(diǎn)，進(jìn)一步推測其治療COVID-19的作用機(jī)制，為清瘟解熱合劑臨床用于新型冠狀病毒肺炎治療，提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 清瘟解熱合劑成分篩選 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái) TCMSP（http：//ibts.hkbu.edu.hk/lsp/tcmsp.php）[5]以“藿香，柴胡，黃芩，連翹，法半夏，草果，茵陳，馬蹄香，甘草，滑石，厚樸，白薇，神曲”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行查詢。中藥復(fù)方通常以口服為主，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）是藥物吸收、分布、代謝、排泄（ADME）中重要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)之一，表示口服藥物的有效成分或活性基被吸收到達(dá)體循環(huán)并吸收的速度與程度，OB值越高通常表示藥物的生物活性越好[6]。類藥性（drug-like，DL）是指化合物與已知藥物的相似性，是化合物能夠成為藥物的評價(jià)指標(biāo)[7]，通常以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選得到清瘟解熱合劑的活性成分。

1.2 有效成分靶點(diǎn)的預(yù)測和基因名的確定 采用TCMSP數(shù)據(jù)庫對清瘟解熱合劑的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，再利用 UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）[8]規(guī)范與活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白，獲得靶點(diǎn)對應(yīng)的基因名。

1.3 疾病靶點(diǎn)的篩選 以“corona virus disease 2019”和“novel coronavirus pneumonia”作為關(guān)鍵詞，在 OMIM 數(shù)據(jù)庫[9]（http：//omim.org/）和 Genecards數(shù)據(jù)庫[10（]https：//www.genecards.org）中搜索疾病相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用Venny平臺(tái)（版本2.1，http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將清瘟解熱合劑作用靶點(diǎn)與COVID-19靶點(diǎn)取交集，得到清瘟解熱合劑治療COVID-19的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)建立 將1.3得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）[11]，得到蛋白相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖。蛋白間的連線越多，關(guān)聯(lián)度越大，成為核心靶點(diǎn)的概率越高。

1.5 GO分析和KEGG分析 將篩選出來的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 DAVID 數(shù)據(jù)庫[12]（http：//www.david.niaid.nih.gov）中進(jìn)行基因功能（gene oncology，GO）富集分析，運(yùn)用 KOBAS3.0 數(shù)據(jù)庫（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn）對核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）基因通路富集分析，以 p≤0.05、q≤0.05作為篩選指標(biāo)，并對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.6 藥物成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的建立 在Cytoscape3.7.2[13]中導(dǎo)入預(yù)測藥物的活性成分、核心靶點(diǎn)以及相關(guān)聯(lián)的通路，構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)對其相互作用機(jī)制進(jìn)行闡述。

1.7 清瘟解熱合劑藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立 方中飲片的歸經(jīng)信息從2015年版《中國藥典》中獲取，通過查取歸經(jīng)信息構(gòu)建清瘟解熱合劑的藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 清瘟解熱合劑成分篩選結(jié)果 清瘟解熱合劑活性成分篩選共得到1 357種，其中甘草280種、法半夏116種、藿香94種、茵陳53種、草果59種、連翹150種、黃芩58種、柴胡288種、馬蹄香3種、滑石1種、白薇81種、炒厚樸139種、炒神曲35種。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18，篩選后共有264種成分符合條件，見圖 1、表 1。

表1 清瘟解熱合劑包含化學(xué)成分的對應(yīng)靶標(biāo)數(shù)

圖1 清瘟解熱合劑各味藥物主要有效成分?jǐn)?shù)量

2.2 有效成分靶點(diǎn)收集結(jié)果 在TCMSP中查詢到510個(gè)有效成分靶點(diǎn)，將有效成分靶點(diǎn)名稱導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫，得到靶點(diǎn)對應(yīng)的基因名。

2.3 疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果 在OMIM數(shù)據(jù)庫和Genecards數(shù)據(jù)庫中共收集到752個(gè)COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)，其中OMIM數(shù)據(jù)庫中有493個(gè)靶點(diǎn)，Genecards數(shù)據(jù)庫中有259個(gè)靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)和藥物成分靶點(diǎn)，取交集最終得到32個(gè)清瘟解熱合劑治療COVID-19的潛在靶點(diǎn)，見圖2。

圖2 藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中有30個(gè)作用節(jié)點(diǎn)，共231條相互作用連線。其中白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、趨化因子（C-C motif ligand 2，CCL2）和絲裂原活化蛋白激酶 1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）的連通度較高，是核心靶點(diǎn)，見圖3、表2。

表2 靶點(diǎn)連通度

2.5 靶點(diǎn)通路分析 GO功能富集分析得到GO條目共283條，其中生物過程（BP）條目226個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目 26個(gè)，分子功能（MF）條目 31個(gè)，分別占80%、9%、11%。我們根據(jù)P值將生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）中的各前 15名列出，見表3。

圖3 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

表3 清瘟解熱合劑GO生物功能富集分析

KEGG通路富集分析共得到232條通路，根據(jù)p值篩選出與COVID-19有關(guān)的前10條通路，包括IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、Th17細(xì)胞分化（Th17 cell differentiation）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等通路，見表4。

2.6 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出來靠前的30條通路和藥物預(yù)測有效成分和疾病潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)來闡釋其復(fù)雜的作用機(jī)制，不同節(jié)點(diǎn)分別代表、成分、靶點(diǎn)、通路。紅色三角代表-靶點(diǎn)，藍(lán)色四邊代表-信號通路，綠色四邊代表-活性成分，連線代表-各點(diǎn)之間的相互關(guān)系，見圖4。

2.7 清瘟解熱合劑藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)清瘟解熱合劑的歸經(jīng)信息，構(gòu)建藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，圖中黃色方塊表示藥材，綠色圓表示歸經(jīng)。途中連接最密切的三個(gè)節(jié)點(diǎn)是肺 lung）、脾（spleen）和胃（stomach），連接度分別是8，8，8，說明大多數(shù)藥材的歸經(jīng)是肺經(jīng)、脾經(jīng)和胃經(jīng)。清瘟解熱合劑中13味中藥大部分中藥歸肺、脾、胃三經(jīng)，說明可能對由“濕熱”導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎具有很好的治療作用，見圖5。

表4 KEGG富集通路分析結(jié)果

圖4 清瘟解熱合劑治療新型冠狀病毒肺炎“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 清瘟解熱合劑藥材-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

自新型冠狀病毒肺炎爆發(fā)以來，全國疫情防控阻擊戰(zhàn)取得重大戰(zhàn)略成果，然而世界范圍內(nèi)，情況依然不容樂觀。針對新型冠狀病毒肺炎，目前臨床還沒有特效藥。雖然有報(bào)道稱已經(jīng)篩選了部分藥物用于臨床，但其是否有確切的治療作用尚不明確，部分藥物還處于試驗(yàn)階段，不能廣泛運(yùn)用于治療中。中醫(yī)藥作為我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥，在疫病的防治上具有獨(dú)特的見解。2003年，中醫(yī)藥用于重癥急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）治療的有效性和安全性得到了廣泛的認(rèn)可[14]。吳鞠通的《溫病條辨》云：“溫疫者，厲氣流行，多兼穢濁，家家如是，若役使然也?！盵4]新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)范疇屬于“疫病”，致病原因多為外感疫毒邪氣，入里化熱，在臨床上以“急則治標(biāo)，緩則治本，標(biāo)本兼治”作為治療原則，祛邪外出的同時(shí)兼顧扶助正氣。最新發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診治方案（試行第七版）》[15]指出，患者以發(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹瀉等癥狀。從中醫(yī)的角度分析，其病位在肺，兼在脾胃，病因?yàn)椤皾穸疽摺?，因邪氣侵肺，耗傷衛(wèi)氣而出現(xiàn)發(fā)熱、咽痛咳嗽；濕邪困脾而導(dǎo)致大便黏膩臭穢或便溏腹瀉。根據(jù)中醫(yī)理論分析，清瘟解熱合劑中的藥物多歸肺脾胃經(jīng)，主要治療邪犯肺衛(wèi)、濕邪困脾。半夏、藿香辛溫歸脾胃肺經(jīng)，能化濕止嘔；茵陳清利濕熱；草果燥濕溫中，截瘧祛痰；連翹、黃芩苦寒，清熱解毒、疏散風(fēng)熱、燥濕；柴胡疏散退熱，升舉陽氣；甘草補(bǔ)脾益氣，抵抗病邪；馬蹄香、滑石、白薇能利尿通淋；厚樸燥濕行氣、消痰平喘；神曲能消食和胃。使用此方能清熱化濕，芳香避穢，燥濕止瀉，在臨床治療患者具有良好的療效。

基于臨床治療結(jié)果，部分SARS-CoV-2感染者后期病癥加重，甚至出現(xiàn)死亡的情況，可能與“炎癥風(fēng)暴”有關(guān)，而“炎癥風(fēng)暴”的本質(zhì)是細(xì)胞因子風(fēng)暴（cytokine storm）。細(xì)胞因子在人體中有著重要的作用，調(diào)控細(xì)胞增殖和分化、血管發(fā)生、免疫和炎癥反應(yīng)等。當(dāng)患者感染病毒后，血清中的促炎因子會(huì)增加，從而導(dǎo)致肺部炎癥和相應(yīng)的肺組織損傷。過度的免疫反應(yīng)激活大量的免疫細(xì)胞，對肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管造成彌漫性損傷，大量液體滲出到氣管中阻塞氣道，從而造成呼吸窘迫[16]。蛋白互作分析結(jié)果表明，IL6、TNF、CCL2、MAPK1等可能為清瘟解熱合劑治療COVID-19的核心靶點(diǎn)。此外，通過比較KEGG通路富集分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些核心靶點(diǎn)顯著富集在IL-17信號通路、Th17細(xì)胞分化、腫瘤壞死因子信號通路等通路上。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）是一種細(xì)胞中的重要信號傳導(dǎo)分子[17]，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，MAPK激活后可促進(jìn)細(xì)胞癥因子表達(dá)[18-19]。與此同時(shí)，一些促炎性因子如TNF-α、IL6等，都可以激活MAPK通路從而加劇炎癥反應(yīng)[17]。在炎癥反應(yīng)中，TNF-α是一種出現(xiàn)最早、最重要的炎性因子，主要由單核巨噬細(xì)胞以及其它免疫細(xì)胞產(chǎn)生。在機(jī)體感染病毒時(shí)，TNF-α可通過激活 T細(xì)胞促進(jìn) IL-1、IL-6、IL-8和IL-12等細(xì)胞因子的產(chǎn)生及分泌，從而介導(dǎo)一系列炎性反應(yīng)[20]。CC趨化因子配體2（CCL2）是CC類趨化因子家族的成員，是人類發(fā)現(xiàn)最早的、有活性的趨化因子。當(dāng)CCL2與其相應(yīng)受體結(jié)合后可活化單核/巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和Th2細(xì)胞，并向炎癥部位聚集。有研究表明由支氣管上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的CCL2可能會(huì)加重氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性[21]。對肺炎患者血清中的細(xì)胞因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)重癥患者血清中的IL-6、TNF-α等明顯高于非重癥患者，這說明這些患者癥狀的加重與這些細(xì)胞因子的升高有關(guān)。Th17細(xì)胞是新型CD4+T細(xì)胞亞群，在免疫調(diào)節(jié)方面具有至關(guān)重要的作用，Th17細(xì)胞可以分泌IL-6、TNF-α和IL-17等多種效應(yīng)因子，并通過其來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。IL-6可以調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的數(shù)目并誘導(dǎo)其發(fā)育[22]。因此，清瘟解熱合劑可能通過調(diào)控這些通路改善COVID-19患者的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對清瘟解熱合劑中有效成分治療新型冠狀病毒肺炎的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，清瘟解熱合劑可能是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路來協(xié)同作用的。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是大數(shù)據(jù)時(shí)代下的新興的學(xué)科，通過虛擬篩選技術(shù)初探了清瘟解熱合劑對COVID-19的治療作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，但由于研究方法本身具有局限性，需要在臨床中進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。