卵圓細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)差異性甲基化基因的篩選及驗(yàn)證

汪鑫，閆亮亮，安然，程亞，王恒毅

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，a急診外科，b 風(fēng)濕免疫科，安徽 合肥230032

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國(guó)最常見(jiàn)且惡性程度最高的腫瘤之一，占我國(guó)癌癥死亡率的第2位［1］。肝癌的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。卵圓細(xì)胞（oval cell）是一類定植于膽管的核圓少漿的上皮細(xì)胞，在特定的疾病或病理生理?xiàng)l件下，可被激活并增殖［2-3］。其被認(rèn)為是肝臟前體干細(xì)胞，具有腫瘤干細(xì)胞的特征。在致癌因素作用下，卵圓細(xì)胞高速增殖，基因組結(jié)構(gòu)不穩(wěn)，分化失控，繼而發(fā)育停滯，惡性轉(zhuǎn)化為肝癌細(xì)胞［4-5］。但卵圓細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制仍未闡釋清楚。

我們將肝細(xì)胞癌基因HBV X（HBX）轉(zhuǎn)染大鼠肝卵圓細(xì)胞（LE6細(xì)胞系）后發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染HBX卵圓細(xì)胞（HBX-LE6）發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化，在動(dòng)物模型中，HBX-LE6細(xì)胞在肝內(nèi)形成間質(zhì)瘤細(xì)胞和肝癌細(xì)胞組成的肝癌肉瘤［6-7］，但致癌因素誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的表觀遺傳學(xué)機(jī)制尚未闡明。根據(jù)表觀遺傳致癌假說(shuō)，致癌因素的暴露能改變細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)模式，進(jìn)而引起基因活性和細(xì)胞表型的改變，引發(fā)原癌基因的活化和腫瘤抑制基因滅活，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。DNA甲基化（DNA methylation）是目前研究最為廣泛的表觀遺傳現(xiàn)象。低甲基化造成腫瘤細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定，并促使致癌基因活化。抑癌基因的高甲基化可以直接抑制其表達(dá)或基因沉默，引起細(xì)胞惡變，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

本研究于2017年1月至2018年5月首先利用簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序（Reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）對(duì)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的卵圓細(xì)胞HBXLE6與正常LE6細(xì)胞進(jìn)行甲基化測(cè)序，獲得差異性甲基化區(qū)域（Differentially methylated region，DMR），通過(guò)基因注釋獲得相關(guān)差異性甲基化基因（Differentially methylated gene，DMG），并進(jìn)行驗(yàn)證，探索DNA甲基化參與卵圓細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料卵圓細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)（馬納薩斯，弗吉尼亞州），TRIzol試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，SYBR Green和HiScript IIQ RT SuperMix購(gòu)于南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司，qPCR引物核酸序列由上海生物工程有限公司合成，多克隆抗體和二級(jí)抗體均購(gòu)于于北京博奧森生物公司，甲基化試劑盒和甲基化抑制劑5-Aza-CdR購(gòu)于Zymo Research公司。

1.2方法

1.2.1 分組 HBX+LE6組：穩(wěn)定表達(dá)HBX的惡性轉(zhuǎn)化后卵圓細(xì)胞；LE6組：正常大鼠卵圓細(xì)胞LE6；5-Aza-CdR+HBX-LE6組：培養(yǎng)基中加入5-Aza-CdR處理72 h后的HBX-LE6卵圓細(xì)胞。

1.2.2 高通量甲基化測(cè)序 通過(guò)Illumina HiSeqTMPE125/PE150系統(tǒng)獲得原始圖像，數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為測(cè)序讀段（Sequenced Reads）。使用BiSeq軟件（1.6版）識(shí)別DMR。使用MethylKit軟件（1.0.0版）計(jì)算差值甲基化的P值。DMR標(biāo)準(zhǔn)閾值為P＜0.05，甲基化率差異大于10%。對(duì)DMR進(jìn)行區(qū)域、基因注釋，獲得差異性甲基化相關(guān)基因及DMR在基因功能區(qū)域的定位。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time qPCR）檢測(cè) （1）反應(yīng)體系：SybrGreen Mixture 12.5μL，互補(bǔ)DNA（cDNA）模板2.5μL，正向引物（10μmol/L）0.5μL，反向引物（10μmol/L）0.5μL，雙蒸餾水（ddH2O）9μL，總體積為25μL。（2）反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性25 s，退火時(shí)間25 s，72 ℃延伸45 s，共45個(gè)循環(huán)。Real-time qPCR引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè) 以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參對(duì)照，細(xì)胞用細(xì)胞裂解液處理，在冰浴中勻漿。用BCA法蛋白定量。采用凝膠成像分析系統(tǒng)計(jì)算目的條帶的積分光密度、根據(jù)目的條帶的灰度值與內(nèi)參照β-actin的灰度值之比值行定量分析。

表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time qPCR）引物核酸序列

1.2.5 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylation specific polymerase chain reaction，MSP）檢測(cè) （1）引物序列：甲基化特異性引物M-forward 5’-GTTCGTCGTCGT TTTTTAGGC-3’，和M-reverse5’-AAAAACCAACG ACCCCCGCG-3’，非甲基特異性引物為U-forward，U-forward5’-AGT TTGTTGTTGTTTTTTAGGTGG-3’，和 U-reverse 5’-AAAAAACCAACAA CCCCCACA-3’，擴(kuò)增片段均為108 bp。（2）反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L dNTP）1.6μL，正向引物（10μmol/L）0.4μL，反向引物（10μmol/L）0.4μL，修飾后的DNA 2μL，DNA聚合酶0.1μL，去離子水13.5μL，總體積20μL。（3）反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，甲基化特異性引物58℃退火30 s，非甲基化特異性引物54℃30 s，然后72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸6 min反應(yīng)完成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件，正態(tài)分布資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。對(duì)于DMR 的鑒定，采用軟件 BiSeq（1.6.0）、methylKit（1.0.0）進(jìn)行檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1高通量甲基化測(cè)序結(jié)果HBX和HBX-LE6細(xì)胞共篩選出1 434個(gè)DMR。其中高甲基化623個(gè)（位于啟動(dòng)子128個(gè)），低甲基化811個(gè)（位于啟動(dòng)子216個(gè)）。通過(guò)DMR基因注釋，共篩選DMG 1 987個(gè)。并按統(tǒng)計(jì)顯著性排序，列出了前20位明顯高甲基化DMR和DMG，見(jiàn)表2。

2.2 Real-time qPCR檢測(cè)結(jié)果SMARCB1、CYLD、ZBTB16、USP18在HBX-LE6組中的mRNA表達(dá)量相對(duì)值較LE6組均顯著下調(diào)。SMARCB1高甲基化被5-Aza-CdR抑制后，5-Aza-CdR+HBX-LE6組中的mRNA表達(dá)較抑制前HBX-LE6組顯著上調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)表3，4。

表4 LE6、HBX-LE6和5-Aza-CdR+HBX-LE6三組中SMARCB1、CYLD、ZBTB16、USP18的相對(duì)表達(dá)量比較/

表4 LE6、HBX-LE6和5-Aza-CdR+HBX-LE6三組中SMARCB1、CYLD、ZBTB16、USP18的相對(duì)表達(dá)量比較/

注：HBX-LE6為轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌基因HBV X（HBX）發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的大鼠肝卵圓細(xì)胞，LE6為正常大鼠肝卵圓細(xì)胞，5-Aza-CdR+HBXLE6為培養(yǎng)基中加入5-Aza-CdR處理72h后的HBX-LE6卵圓細(xì)胞，SMARCB1為SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物，CYLD為腫瘤抑制因子，ZBTB16為含16的鋅指和BTB結(jié)構(gòu)域蛋白，USP18為泛素特異性蛋白酶18基因。與HBX-LE6組比較，aP＜0.05

USP18 4.50±0.43 2.09±0.18 2.09±0.13 0.300 0.724組別LE6 HBX-LE6 5-Aza-CdR+HBX-LE6 F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 SMARCB1 7.34±0.11 2.57±0.29 7.31±0.12a 4 018.000＜0.001 CYLD 7.30±0.27 3.44±0.13 3.5±0.08 0.138 0.874 ZBTB16 7.01±0.06 1.29±0.32 1.33±0.09 0.600 0.586

表2 轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌基因HBV X（HBX）發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的大鼠肝卵圓細(xì)胞HBX-LE6與正常大鼠肝卵圓細(xì)胞LE6間位于啟動(dòng)子差異性高甲基化區(qū)域列表（前20位）

表3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time qPCR）分別檢測(cè)HBX-LE6與LE6兩組中USP18、MAP3K6、SMARCB1、EGFR、CYLD、RNF39、ZBTB16、HOXD8的mRNA相對(duì)表達(dá)量/

表3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time qPCR）分別檢測(cè)HBX-LE6與LE6兩組中USP18、MAP3K6、SMARCB1、EGFR、CYLD、RNF39、ZBTB16、HOXD8的mRNA相對(duì)表達(dá)量/

注：HBX-LE6為轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌基因HBV X（HBX）發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的大鼠肝卵圓細(xì)胞，LE6為正常大鼠肝卵圓細(xì)胞，RNF39為環(huán)指蛋白39，SMARCB1為SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物，MAP3K6為有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶6，EGFR為表皮生長(zhǎng)因子受體，HOXD8同源異型盒基因D8，CYLD為腫瘤抑制因子，ZBTB16為含16的鋅指和BTB結(jié)構(gòu)域蛋白，USP18為泛素特異性蛋白酶18基因

USP18 4.50±0.43 2.09±0.18 6.848 0.021 LE6 HBX-LE6 t值P值3 3 5.00±0.02 4.95±0.03 2.186 0.094 7.34±0.11 2.57±0.29 34.860 0.001 7.30±0.12 7.31±0.07 0.230 0.829 7.44±0.01 7.41±0.02 2.219 0.091 8.56±0.08 8.46±0.02 2.249 0.088 7.30±0.27 3.44±0.13 32.180 0.001 7.01±0.06 1.29±0.32 33.620 0.001組別 重復(fù)次數(shù)RNF39SMARCB1MAP3K6EGFRHOXD8CYLDZBTB16

2.3蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果USP18、ZBTB1、CYLD的蛋白表達(dá)在三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與LE6相比，SMARCB1在HBX-LE6中的蛋白表達(dá)下調(diào)，SMARCB1高甲基化被5-Aza-CdR抑制后，其蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001）。見(jiàn)圖1、表5。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)5-Aza-CdR+HBX-LE6、HBX-LE6、LE6三組中ZBTB16、CYLD、SMARCB1、USP18的蛋白表達(dá)

表5 LE6、HBX-LE6、5-Aza-CdR+HBX-LE6三組中SMARCB1、CYLD、ZBTB16、USP18的蛋白表達(dá)比較/

表5 LE6、HBX-LE6、5-Aza-CdR+HBX-LE6三組中SMARCB1、CYLD、ZBTB16、USP18的蛋白表達(dá)比較/

注：LE6為正常大鼠肝卵圓細(xì)胞，HBX-LE6為轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌基因HBV X（HBX）發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的大鼠肝卵圓細(xì)胞，5-Aza-CdR+HBX-LE6為培養(yǎng)基中加入5-Aza-CdR處理72h后的HBX-LE6卵圓細(xì)胞，SMARCB1為SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物，CYLD為腫瘤抑制因子，ZBTB16為含16的鋅指和BTB結(jié)構(gòu)域蛋白，USP18為泛素特異性蛋白酶18基因。與LE6組比較，aP＜0.01；與HBX-LE6組比較，bP＜0.01

USP18 8.45±0.21 8.32±0.14 8.29±0.19 11.734 0.075組別LE6 HBX-LE6 5-Aza-CdR+HBX-LE6 F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 SMARCB1 6.26±0.25 1.53±0.34a 7.55±0.32b 34 309.000＜0.001 CYLD 1.62±0.22 1.58±0.17 1.72±0.23 10.331 0.082 ZBTB16 4.33±0.03 4.31±0.15 4.29±0.09 2.400 0.172

2.4 MSP檢測(cè)5-Aza-CdR+HBX-LE6、HBX-LE6和LE6三組中SAMRCB1基因的甲基化狀態(tài)分別用“M”（甲基化特異性引物）和“U”（非甲基化特異性引物）進(jìn)行擴(kuò)增。LE6、HBX-LE6用U引物擴(kuò)增都有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，M引物僅在HBX-LE6有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。在5-Aza-CdR干預(yù)后，5-Aza-CdR+HBXLE6中U引物有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，M引物無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。見(jiàn)圖2。

圖2 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）檢測(cè)LE6、HBX-LE6和5-Aza-CdR+HBX-LE6三組中SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物（SMARCB1）基因的甲基化狀態(tài)

3 討論

DMR指在不同樣本之間，甲基化修飾水平具有顯著差異的基因組區(qū)域，這些區(qū)域在基因表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果共獲得DMR 1 434個(gè)，其中高甲基化DMR 623個(gè)（位于啟動(dòng)子128個(gè)），低甲基化DMR 811個(gè)（位于啟動(dòng)子216個(gè)）。通過(guò)DMR基因注釋獲得DMG 1 987個(gè)。從中挑選出高甲基化相關(guān)基因 USP18、MAP3K6、SMARCB1、EGFR、CYLD、RNF39、ZBTB16、HOXD8進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明：CYLD、ZBTB16、USP18在HBX-LE6中的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。已知USP18與肺癌關(guān)系密切，改變USP18水平會(huì)影響肺癌細(xì)胞cyclinD1蛋白的穩(wěn)定性［8］。ZBTB16蛋白含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和一個(gè)BTB結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為與調(diào)控細(xì)胞自噬有關(guān)［9］。CYLD被認(rèn)為是抑癌基因，其去泛素化活性調(diào)控NF-κb及JNK等信號(hào)途徑，在抑制腫瘤方面發(fā)揮重要作用［10］。在5-Aza-CdR抑制其甲基化后，三種基因mRNA表達(dá)水平并未明顯上調(diào)。表明啟動(dòng)子高甲基化并非其mRNA表達(dá)下調(diào)的單一因素。USP18、ZBTB1、CYLD的蛋白表達(dá)在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與基因轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平等多重調(diào)控有關(guān)。

與LE6相比，SMARCB1在HBX-LE6中的蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05），與其mRNA表達(dá)水平下調(diào)一致。進(jìn)一步研究表明，5-Aza-CdR完全抑制了SMARCB1啟動(dòng)子的甲基化，且抑制后HBX-LE6細(xì)胞中SMARCB1的mRNA與蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），表明啟動(dòng)子的高甲基化可能是下調(diào)抑癌基因SMARCB1表達(dá)的主要因素。SMARCB1基因編碼的蛋白是ATP依賴性染色質(zhì)調(diào)節(jié)復(fù)合物SWI/SNF的核心亞基，參與基因的表觀修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)控［11］。SMARCB1基因突變與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，其作為抑癌基因可以誘導(dǎo)細(xì)胞G1停滯、抑制染色體非整倍性等發(fā)揮腫瘤抑制的作用［12-13］。SMARCB1與肝癌發(fā)生的關(guān)系密切。SMARCB1在肝組織中的表達(dá)與肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。敲除SNF5（SMARCB1/INI1/BAF47）的肝癌細(xì)胞系Hep3B和HCCLM3生長(zhǎng)和遷移能力明顯增強(qiáng)［14-16］。

表觀遺傳學(xué)認(rèn)為，表觀遺傳改變?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著主要作用，是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化早期的主要驅(qū)動(dòng)力［17］。在哺乳動(dòng)物基因組中，DNA甲基化的主要位點(diǎn)是CpG二核苷酸，常位于基因上游調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子區(qū)域。啟動(dòng)子區(qū)的CpG島通常處于非甲基化狀態(tài)，基因能正常表達(dá)；當(dāng)其發(fā)生甲基化時(shí)，影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使基因表達(dá)發(fā)生沉默。因此，抑癌基因SMARCB1啟動(dòng)子的高甲基化可能參與了LE6卵圓細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制。但其下游靶基因或效應(yīng)分子為何，以及在體內(nèi)如何影響卵圓細(xì)胞的生物學(xué)特征均需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究應(yīng)用RRBS技術(shù)，獲得轉(zhuǎn)化后大鼠卵圓細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化卵圓細(xì)胞的DMR與DMG，并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證，為研究卵圓細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的表觀遺傳學(xué)機(jī)制提供了重要線索與理論依據(jù)。