1株攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因qnrS1和qepA1的多耐藥沙門菌的基因特點分析

邢 燕，錢玉春，張文艷，胡忠旺，孫 永

沙門菌是一類重要的人獸共患病原體，血清型多達(dá)2 000多種，其中絕大多數(shù)血清型既可存在于動物、環(huán)境中，也可傳播至人。沙門菌感染會引起腹瀉、發(fā)熱等癥狀[1]，屬于自限性疾病，但對于細(xì)菌入血的少數(shù)重癥患者，必須使用抗生素治療。

喹諾酮類抗生素是成人治療沙門菌感染的一線藥物之一。沙門菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥對于治療非常不利。目前沙門菌對一代藥物萘啶酸已表現(xiàn)出明顯耐藥，對第三代藥物環(huán)丙沙星的敏感性仍較高，耐藥率大約在2%～3%[2-3]。

對喹諾酮類藥物耐藥機制的研究表明，喹諾酮耐藥決定區(qū)的基因突變，即位于細(xì)菌染色體上的gyrA、gyrB基因的突變，是導(dǎo)致喹諾酮耐藥的主要原因[4]。隨著研究的深入，由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥相關(guān)基因，如qnr、aac(6′)-Ib-cr、qepA等都被發(fā)現(xiàn)與喹諾酮耐藥有關(guān)[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥通常引起喹諾酮類藥物的MIC濃度降低或藥物敏感性下降，不能達(dá)到臨床耐藥水平[8-10]。但Toyotakasato[11]等人于2011年報道了一例臨床分離的大腸桿菌HUE1，它不含染色體編碼基因的耐藥突變，僅有質(zhì)粒上攜帶的基因qnrS1和oqxAB并表現(xiàn)出環(huán)丙沙星耐藥。

本實驗室在對臨床分離沙門菌菌株的抗生素耐藥篩查中，發(fā)現(xiàn)一株多耐藥菌株SM846，它對喹諾酮類藥物萘啶酸和環(huán)丙沙星都耐藥，在PCR研究耐藥機制時，沒有檢測到gyrA和gyrB基因的突變。隨后對它進(jìn)行了全基因組測序及序列比較分析，來研究它的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1菌株來源及分離鑒定 沙門菌SM846于2014年從1名11個月的嬰兒腹瀉糞便標(biāo)本中分離。沙門菌從沙門顯色培養(yǎng)基(購于上?？岂R嘉)中分離出單個菌落，純菌落使用梅里埃的微生物鑒定系統(tǒng)(購于梅里埃VITEK2)鑒定，經(jīng)血清學(xué)(購于寧波天潤)鑒定為湯普遜沙門菌(S.thompson)。

1.2藥敏試驗 使用thermo公司的SensititreAIM儀器和基于微量肉湯法定制的藥敏板(購于上海星佰)，測定沙門菌SM846對14種抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。試驗菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，用無菌生理水調(diào)整菌懸液濃度至0.5McF，取50 μL菌懸液加入到11 mL CAMHT肉湯中，將稀釋后的菌液(細(xì)菌數(shù)1×105～1×106)接種在藥敏板上。培養(yǎng)24 h，測定結(jié)果。使用大腸桿菌ATCC25922為試驗的質(zhì)控菌株。14種抗生素分別為：氨芐西林(AMP)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、四環(huán)素(TET)、氯霉素(CHL)、頭孢唑林(CFZ)、環(huán)丙沙星(CIP)、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑(SXT)、頭孢他啶(CAZ)、亞胺培南(IPM)、萘啶酸(NAL)、頭孢西丁(CFX)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(GEN)、阿奇霉素(AZM)。根據(jù)CLSI的判讀標(biāo)準(zhǔn)確定MIC值。

1.3全基因組測序 對于組裝基因組的菌株，提供8～10 μg高質(zhì)量的基因組DNA，用Covaris g-TUBE隨機打斷成10 kb左右的片段，隨后用DNA Template Prep試劑盒構(gòu)建SMRTbell文庫。構(gòu)建好的SMRTbell文庫結(jié)合V3測序引物和聚合酶采用自由擴散的方式加入到PacBio Sequel平臺的測序芯片中。測序過程由金唯智公司處理和分析。

1.4測序后數(shù)據(jù)分析 使用Prodigal軟件(version 3.02)進(jìn)行染色體編碼基因預(yù)測[12]；與Rfam(version 12.0)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對獲得非編碼RNA結(jié)果[13]。使用在線網(wǎng)站RAST對質(zhì)粒進(jìn)行注釋[14]。使用resfinder[15]與CARD[16]進(jìn)行耐藥基因的預(yù)測分析。使用SISTR[17]預(yù)測血清型，PlasmidFinder預(yù)測質(zhì)粒類型[18]。使用SnapGene(from GSL Biotech; available at snapgene.com)對質(zhì)粒的編碼基因進(jìn)行展示?；蚪M線圖使用CGView1.3.4[19]生成。質(zhì)粒上耐藥基因圖由ApE軟件制作(available at https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/)。質(zhì)粒序列使用clustalw進(jìn)行比對(available at https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，進(jìn)化樹由軟件mega-X根據(jù)NJ法生成[20]。

2 結(jié) 果

2.1測序菌株信息 SM846的全基因組包含1條染色體和1條質(zhì)粒。染色體全長4 754 945 bp，GC含量52.3%，預(yù)測包含編碼序列4 425個，含64個rRNA，89個tRNA，其它RNA178個。質(zhì)粒全長152 940 bp，GC含量53.4%，預(yù)測包含編碼序列193個，不含RNA。染色體和質(zhì)?；蚪M已提交到NCBI，序列號分別為：CP028729、CP029249?；赟ISTR數(shù)據(jù)庫預(yù)測的血清型為湯普遜，與血清學(xué)鑒定結(jié)果一致?；赑lasmidFinder質(zhì)?；蚪M數(shù)據(jù)庫預(yù)測的質(zhì)粒類型為IncA/C2。SM846測序原始數(shù)據(jù)見表1。

表1 SM846測序原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計信息

2.2 藥敏試驗結(jié)果與耐藥基因分布

2.2.1藥敏試驗 SM846對IPM、GEN敏感，對其它12種抗生素都高度耐藥，包括喹諾酮藥物萘啶酸和環(huán)丙沙星。雖然SM846對喹諾酮耐藥，PCR檢測gyrA和gyrB基因的耐藥突變，沒有獲得任何突變位點的結(jié)果。對SM846進(jìn)行了基因組測序以研究它的喹諾酮耐藥機制(詳見表2)。

表2 SM846藥敏試驗結(jié)果及相關(guān)耐藥基因

2.2.2耐藥基因分布 將SM846序列與ResFinder數(shù)據(jù)庫比對，注釋結(jié)果顯示，SM846的染色體不含有任何和已知耐藥有關(guān)的基因和突變，它有3個parC蛋白的未知突變，分別是p.T57S、p.T255S、p.V657I。它的質(zhì)粒p846攜帶13個耐藥相關(guān)基因，分別是耐氨基糖苷類的aadA2、APH(6)-1d、APH(3″)-1b；耐氯霉素的floR；耐β-內(nèi)酰胺類的blaTEM-1、blaCMY-2；耐喹諾酮類的qnrS1和qepA1；耐大環(huán)內(nèi)酯類mph(A)；耐磺胺類的sul1、sul2；耐四環(huán)素類tet(A)；以及耐甲氧嘧啶的dfrA12(見表1)。由于ResFinder和CARD對耐藥基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)有差別，ResFinder比對的是明確并且特異地與耐藥相關(guān)的耐藥基因，而CARD數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果中還包括外排泵系統(tǒng)和基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)等非特異的基因。CARD數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果，除了包含ResFinder中的耐藥基因，還有30個位于染色體上的基因，分別屬于RND抗生素外排泵、ABC抗生素外排泵、MFS抗生素外排泵、以及上述外排泵基因上下游的正負(fù)調(diào)控基因。

2.3 耐多藥質(zhì)粒信息

2.3.1由于SM846的耐藥基因，包括與喹諾酮耐藥相關(guān)的基因，都在質(zhì)粒上，我們對質(zhì)粒p846進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。p846共編碼193個基因，去除小于100 bp和沒有明確功能的，還有159個。其中13個基因與耐藥相關(guān)。

將p846的序列與NCBI上其它公開數(shù)據(jù)比對，可以得到很多相似度大于99%的質(zhì)粒。表3中列出了代表性的13條質(zhì)粒，分別是4條相似度最高的和9條覆蓋度最高的序列。用ResFinder注釋上述質(zhì)粒的耐藥基因，獲取它們的耐藥基因的攜帶情況(表3)。

表3 p846與相似質(zhì)粒比較

上述質(zhì)粒中，分離時間早的，如分離自2003年和2004年的質(zhì)粒。耐藥性都相對較弱，2013年及以后分離出的則表現(xiàn)出很強的耐藥性；質(zhì)粒菌株來自于人的，耐藥性也強，由于中國分離出的質(zhì)粒都是2010年以后且自人體分離出，因此中國分離的質(zhì)粒都顯示出了很強的耐藥性。以質(zhì)粒的序列進(jìn)行進(jìn)化分析，可以得到2個進(jìn)化簇(見圖1)。與p846親緣關(guān)系近的質(zhì)粒有3個，分別是pCVMN1543、pCFSAN00093402和pRH-1238。其中p846和pRH-1238耐藥性極強，pCVMN1543、pCFSAN000934-02耐藥性一般；p846來自于人分離的菌株，其它3個來自于動物分離的菌株；p846來自中國，pRH-1238來自德國，pCVMN1543和pCFSAN000934-02來自美國。

進(jìn)化分析序列基于以下質(zhì)粒序列：p846，pSN254b，p2012EL-2176，pSL131，punnamed3，pTB221，pCVM22425，pCMY2 085072，pCFSAN007427 01，pCVM22513，pCVMN1543，pCFSAN000934 02，pRH-1238。

為了更深入研究p846的遺傳情況，將p846與上面的質(zhì)粒進(jìn)行序列對比分析。從對比的圈圖，可以看出p846含有2個較為特殊的區(qū)域，P1和P2。pCFSAN007427.01也含有P1區(qū)域，它是一條分離自2009年的美國的沙門菌的質(zhì)粒(見圖2)。在NCBI搜索P1序列，發(fā)現(xiàn)很多宿主細(xì)菌的質(zhì)粒中都含有這段序列，如沙門菌、志賀菌、肺炎鏈球菌等。與P1序列的廣泛存在不同，P2序列特異性較強，它與NCBI中的序列沒有很好的匹配。QepA1和qnrS1基因位于P2序列中，它們正是質(zhì)粒中與喹諾酮耐藥相關(guān)的2個基因。QnrS1在沙門菌質(zhì)粒中分布較為普遍[21]，而qepA1未在耐喹諾酮的沙門菌中發(fā)現(xiàn)過。

由內(nèi)而外分別是GC content、pAR060302、pSN254b、p2012EL-2176、 punnamed3、 pTB221、pCFSAN007427.01、pRH-1238、pCMY2 085072、pSL131、pCFSAN000934_02、 pCVMN1543、pCVM22425、 pCVM22513、 p846。P1和P2是p846中未比對上的序列。

P2序列全長32 048 bp，GC含量57%。共編碼42個基因，其中13個是和基因移動相關(guān)的，如解離酶、轉(zhuǎn)化酶、內(nèi)含子等。攜帶6個耐藥基因——qnrS1、qepA1、dfrA12、sul1、aadA12和mph(a)，分別編碼對喹諾酮類、氨基糖苷類、甲氧嘧啶類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥(見圖3)。P2主要由I類整合子構(gòu)成，包括它的5′端的intI整合酶及3′端的sul1和溴乙錠的耐藥基因以及兩者之間的可變區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)，I類整合子的可變區(qū)包含的幾乎都是與耐藥相關(guān)的基因[22]。在P2的I類整合子序列里，可變區(qū)包含耐藥基因qepA1、dfrA12和aadA2。P2序列的兩端均有IS6和反向重復(fù)序列，提示3′端的qnrS1、5′端的mph(a)基因可能與此相關(guān)。這些插入或整合到I類整合子的耐藥基因的存在，使細(xì)菌獲得在抗生素壓力下的生存優(yōu)勢。

紅色為可移動蛋白；灰色為IR、IS及Tn等可移動元件箭頭方向為基因編碼方向

3 討 論

根據(jù)Resfinder的注釋，parC基因含有3個未知突變p.T57S、p.T255S、p.V657I。經(jīng)過分析，認(rèn)為它們對于蛋白結(jié)構(gòu)的變化影響不大，與喹諾酮耐藥無關(guān)。有以下原因：首先從氨基酸化學(xué)性質(zhì)分析，T和S、V和I都是化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸，不會引起蛋白質(zhì)局部電荷以及疏水性質(zhì)的變化；其次，在Uniport網(wǎng)站搜索到蛋白ParC，已經(jīng)報導(dǎo)的影響功能的氨基酸突變都有標(biāo)注，可以參考，而它不含以上3個突變；第三是從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上，雖然沙門氏菌的parC結(jié)構(gòu)未被解析，但和它高度同源的大腸桿菌ParC結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，這些殘基并不位于關(guān)鍵的結(jié)合界面，不會影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；最后,這幾個突變位點與同期測序的實驗室其它對喹諾酮敏感菌株的突變位點相同(數(shù)據(jù)未列出)，可以說明這些突變對于喹諾酮耐藥是不起作用的，并且p.T57S位點的突變在文獻(xiàn)中已經(jīng)有多次報道，證實其對喹諾酮耐藥是無效的[23]。

綜合染色體和質(zhì)粒序列耐藥基因的注釋結(jié)果，可以確定SM846基因組中和喹諾酮耐藥有關(guān)基因有acrAB-TolC、sdiA、marR,、marA、qnrS1、qepA1。SdiA位于染色體上，它的作用是無效的[24]。MarR、marA都是編碼acrAB的調(diào)控蛋白[25]。QepA1曾在敏感的臨床鼠傷寒沙門菌中檢測出，說明qepA1單獨存在不能介導(dǎo)對喹諾酮耐藥，這與大腸中qepA的研究結(jié)果一致[21-23]。SM846的喹諾酮耐藥可能是由acrAB外排泵，QnrS1靶位結(jié)合蛋白和qepA1外排泵共同作用來實現(xiàn)。QnrS1或者qepA1或者acrAB單獨存在于沙門菌中，均沒有對喹諾酮藥物產(chǎn)生耐藥性的能力。它們組合在一起的具體作用方式，是否與Sato[11]報道的大腸桿菌HUE1的耐藥機制類似，還需要更多的實驗證實。

對IncA/C2質(zhì)粒的分析表明，不同來源的質(zhì)粒，都能在寄生于人和動物的病原體中傳播。當(dāng)同一型的質(zhì)粒位于不同地區(qū)時，它們所攜帶的耐藥基因的數(shù)量和種類會發(fā)生改變，使宿主獲得不同的耐藥能力，說明同源性強的質(zhì)?？赏ㄟ^靈活獲取耐藥基因更好的實現(xiàn)本地化生存[26]。Han等[26]分析了4條質(zhì)粒并與之前發(fā)表的質(zhì)粒進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)相似質(zhì)粒之間的獨特性是由可移動部分造成的。在SM846中也是如此。p846及相似的質(zhì)粒，質(zhì)粒骨架(backbone)區(qū)域在時間跨度十幾年間，相似度達(dá)99%，相對保守。IncA/C2型質(zhì)粒骨架不含qnrS1和qepA1基因，推測抗生素或其它壓力可能促使細(xì)菌在可移動元件的幫助下快速獲得相應(yīng)的耐藥基因，提高細(xì)菌的生存能力。

通過質(zhì)粒信息的比對我們發(fā)現(xiàn)來自于臨床樣本的質(zhì)粒，它們的宿主細(xì)菌種類比動物和環(huán)境來源的樣本要更多樣，也就意味著多耐藥的質(zhì)粒能通過多種病原菌感染人類。應(yīng)當(dāng)注意到，共同的問題包含著不同的細(xì)節(jié)，不同地區(qū)的生態(tài)因素和選擇壓力造成了某一地區(qū)獨特的耐藥模式[27-28]。一項根據(jù)基因組序列分析多耐藥沙門菌的研究表明，不同地區(qū)的耐藥相關(guān)的特征在基因型和表現(xiàn)型上都表現(xiàn)出了地區(qū)差異[27]。因此需要建立地區(qū)性的耐藥監(jiān)測和耐藥控制策略，我們的質(zhì)粒比對結(jié)果也支持這個觀點。在p846相似的質(zhì)粒中，耐藥相關(guān)性最強的質(zhì)粒來自中國和海地，這2個國家都是經(jīng)濟不夠發(fā)達(dá)，在抗生素使用管理上可能不夠完善，這兩個地區(qū)的細(xì)菌耐藥性更強，不適宜直接套用發(fā)達(dá)國家對于抗生素管理和控制的策略，因為它們的策略是建立在自己的細(xì)菌耐藥監(jiān)測的結(jié)果上的。值得一提的是分離自德國的質(zhì)粒pRH-1238，它攜帶的耐藥基因數(shù)量最多，達(dá)到20個，所屬的抗生素類型也是最多，可耐9種類型的抗生素。對這條質(zhì)粒上耐藥基因fosA3的分析表明，它很可能來自中國[29]。我們根據(jù)基因組序列所做的進(jìn)化分析顯示,德國分離的pRH-1238與中國分離的p846在進(jìn)化上確實屬于一個分支，支持了這個質(zhì)粒可能與中國有關(guān)的結(jié)論。因此，不同地區(qū)的細(xì)菌耐藥監(jiān)測是必要的，各地區(qū)自己的耐藥監(jiān)測結(jié)果才是制定其耐藥策略的最合理的依據(jù)，也只有根據(jù)合理的依據(jù)，才能得到有效的控制策略，切實減輕疾病負(fù)擔(dān)。SM846攜帶qnrS1和qepA1來介導(dǎo)對喹諾酮的耐藥，這個發(fā)現(xiàn)正是我們監(jiān)測的成果之一。

利益沖突：無