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    調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在布魯氏菌感染中的變化特點(diǎn)研究

    2020-12-07 01:45:04王昌敏郝立君盧佩佩李智偉
    關(guān)鍵詞:布魯菌布病布魯氏菌

    劉 熔,王昌敏,郝立君,盧佩佩,李智偉

    布魯菌病是全球最常見的人獸共患病之一[1]。布魯氏菌導(dǎo)致的感染如得不到及時(shí)診斷和規(guī)范治療常會(huì)導(dǎo)致慢性化,有時(shí)甚至是終身的。目前關(guān)于布魯菌病轉(zhuǎn)變?yōu)槁誀顟B(tài)的原因仍不明確。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在布魯氏菌感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。Treg細(xì)胞是發(fā)揮免疫抑制的重要細(xì)胞,可以預(yù)防感染過(guò)程中的免疫病理?yè)p害和抵御過(guò)度活躍的免疫反應(yīng)對(duì)宿主的傷害,F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子,IL-10是Treg 細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種重要的抗炎免疫抑制細(xì)胞因子[3]。本文通過(guò)流式細(xì)胞術(shù),熒光定量PCR和Aimplex方法評(píng)估Treg細(xì)胞,F(xiàn)oxp3的mRNA表達(dá)及IL-10水平在布魯氏菌感染中的變化特點(diǎn)和相關(guān)性。為布魯菌病的免疫應(yīng)答機(jī)制提供一定的理論依據(jù),為布魯菌病的治療尋找新的治療靶點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1研究對(duì)象 收集2019年6-12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院就診并明確診斷為布魯菌病的患者49例,其中急性期20例,慢性期29例,分別設(shè)立急性布病組和慢性布病組。納入標(biāo)準(zhǔn):符合WS 269-2019《布魯菌病診斷》的標(biāo)準(zhǔn),臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、骨關(guān)節(jié)痛、全身乏力等,虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)進(jìn)行初篩陽(yáng)性和試管凝集試驗(yàn)(SAT)檢測(cè)血清中抗布魯氏菌特異性抗體,滴度≥1∶50者。同期募集52例健康體檢人群作為正常對(duì)照組,性別年齡與急、慢性布病組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3組人員均進(jìn)行了虎紅平板試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn),急、慢性布病組發(fā)熱時(shí)進(jìn)行血培養(yǎng)檢測(cè)。3組人員均排除腫瘤、傷寒、風(fēng)濕熱、結(jié)核、自身免疫病和其他各種感染等疾病的人員。所有人員均簽署知情同意書,本研究經(jīng)過(guò)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn),患者知情同意,批準(zhǔn)號(hào):KY201803742。

    1.2儀器與試劑 美國(guó)BD FACS Canto plus流式細(xì)胞儀,美國(guó)Bio-Rad實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。美國(guó)BD的CD3 PerCP(552851,SP34-2),CD4 FITC(550628,L200),CD25 APC(555434,M-A251),CD127 PE(561028,HIL-7R-M21),溶血素(349202)。美國(guó)GE淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Paque密度梯度液(17-5442-02),北京全式金TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(AT311),凱捷T QuantiNava SYBR Green Kit(208054),愛信 Trizol試劑(abs9331)。

    1.3 方 法

    1.3.1樣本處理 采集20例急性布魯菌病患者、29例慢性布魯菌病患者和52例正常對(duì)照組人群的全血標(biāo)本,使用EDTA抗凝。分為3管,1管直接使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞表型和數(shù)量;1管用淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Paque密度梯度液(美國(guó)GE)依照說(shuō)明書操作步驟提取PBMC,加入TRLZOL凍入-80 ℃低溫冰箱保存,用于mRNA檢測(cè);另1管3 000 r/min離心5 min吸取上清轉(zhuǎn)移至EP管,-80 ℃低溫冰箱保存,用于IL-10檢測(cè)。

    1.3.2流式檢測(cè) 吸取全血樣本100 μL,分別加入CD3 PerCP 20 μL,CD4 FITC 20 μL,CD25 APC 5 μL,CD127 PE 20 μL。避光室溫放置15 min,加入2 mL溶血素10 min后離心去上清,加入2 mL PBS洗滌離心去上清,加入500 μL PBS,重懸。上BD FACS canto plus流式細(xì)胞儀檢測(cè),使用FlowJo 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    1.3.3熒光定量PCR檢測(cè) 使用qRT-PCR檢測(cè)Treg轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的mRNA水平。將凍存的標(biāo)本取出,依照說(shuō)明書步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴(kuò)增體系條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán),結(jié)果用2-△△Ct相對(duì)定量法,分別對(duì)布魯菌病組與正常對(duì)照組中的目的基因進(jìn)行定量。引物序列由上海生工合成,F(xiàn)oxP3 5′-FGTGGCCCGGATGTGAGAAG-3′;FoxP3 5′-RGGAG-CCCTTGTCGGATGATG-3′;β-Actin-F-5′:CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,β-Actin-R-5′-CT-CCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

    1.3.4IL-10檢測(cè) 將凍存的EP管取出,依照Aimplex試劑盒說(shuō)明書準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品,使用BD FACS canto plus流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光微球,保存流式細(xì)胞儀的FCS數(shù)據(jù)文件,并利用軟件FCAP Array 3.0進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果分析。

    2 結(jié) 果

    2.1研究對(duì)象概況 本研究共納入急性布魯菌病患者20例,年齡26~62歲,平均年齡44.3±8.7歲,慢性布魯菌病患者29例,年齡22~71歲,平均年齡43.1±8.6歲。正常對(duì)照組52人,年齡25~72歲,平均年齡44.7±7.4歲。詳見表1。

    表1 急慢性布病組與正常對(duì)照組的基本資料

    2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+CD4+CD25+CD127low的Treg細(xì)胞數(shù)量與表型。結(jié)果見圖1和表2,與正常對(duì)照組相比,急性布病組的Treg細(xì)胞比例增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.87,P=0.01);慢性布病組Treg細(xì)胞比例顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.82,P<0.01)。與急性布病組相比,慢性布病組Treg細(xì)胞比例顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.96,P<0.01)。

    表2 Treg、Foxp3和IL-10水平

    注:A為正常對(duì)照組;B為急性布病組;C為慢性布病組。

    2.3熒光定量PCR檢測(cè)Foxp3 mRNA 使用qRT-PCR檢測(cè)PBMC的Foxp3 mRNA水平。結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,急性布病組的Foxp3 mRNA表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.42,P<0.01);慢性布病組Foxp3 mRNA表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.89,P<0.01)。與急性布病組相比,慢性布病組Foxp3 mRNA表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.38,P=0.02),如圖2和表2所示。

    注:A Treg比例,B為Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平,B為IL-10水平。 與正常對(duì)組相比:②P<0.05,③P<0.01;與急性布病組相比:⑤P<0.05,⑥P<0.01。

    2.4IL-10水平檢測(cè)結(jié)果 本研究使用Aimplex法檢測(cè)外周血漿中的IL-10水平。結(jié)果表明,與正常對(duì)照組相比,急性布病組的IL-10水平增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.90,P<0.01);慢性布病組IL-10水平增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.42,P<0.01)。與急性布病組相比,慢性布病組IL-10水平增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.64,P<0.01),如圖2和表2所示。

    2.5Treg細(xì)胞與Foxp3 mRNA,IL-10的相關(guān)性 分析布魯菌病患者的Treg數(shù)量與Foxp3 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性以及Treg數(shù)量與IL-10表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果表明,F(xiàn)oxp3 mRNA和Treg數(shù)量呈正相關(guān)(R=0.72,P<0.01),IL-10水平與Treg數(shù)量呈正相關(guān)(R=0.71,P<0.01),如圖3。

    注:A為Foxp3與Treg相關(guān)性分析,B為IL-10與Treg相關(guān)性分析

    3 討 論

    布魯菌病慢性患者較多[4],免疫機(jī)制不清,給患者身體健康帶來(lái)極大危害。布魯氏菌作為胞內(nèi)寄生菌,T淋巴細(xì)胞主導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抵御布魯氏菌感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。宿主無(wú)法抵御布魯氏菌長(zhǎng)期感染的原因可能是由于適應(yīng)性免疫反應(yīng)減弱而導(dǎo)致。CD4+T細(xì)胞參與了適應(yīng)性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)[6],可以通過(guò)分化成不同的亞型調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答,Treg細(xì)胞是一種具有免疫抑制活性的CD4+T細(xì)胞亞群,對(duì)于各種病理和生理學(xué)免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)控至關(guān)重要。Treg細(xì)胞除了可抑制外部或自身抗原的過(guò)度免疫反應(yīng),還可防止多種自身免疫性疾病[7],最重要的是Treg細(xì)胞也與病原體感染和癌癥相關(guān)的過(guò)度免疫反應(yīng)的負(fù)向控制有關(guān),在某些情況下可能對(duì)宿主有害,導(dǎo)致慢性感染[8]。布魯氏菌慢性化程度較高的原因可能與Treg細(xì)胞數(shù)量增多有關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示,在布魯菌病患者的Treg細(xì)胞數(shù)量升高,慢性布病患者升高更為顯著,Hasanjani等[10]也發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在布魯菌病患者中顯著增多的現(xiàn)象,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在布魯氏菌持續(xù)感染中Tregs細(xì)胞保持其抑制功能[11]。因此,研究結(jié)果表明Treg細(xì)胞參與了布魯菌病的發(fā)生和發(fā)展。由于Treg細(xì)胞的增多可以有效抑制炎癥反應(yīng),Treg細(xì)胞可以增加免疫細(xì)胞上的抑制性表面分子如B7的表達(dá),并下調(diào)抗原提呈細(xì)胞功能,競(jìng)爭(zhēng)性抑制APC細(xì)胞上的協(xié)同共刺激分子活化。Treg還能抑制NK細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒作用[12]。Treg細(xì)胞上表達(dá)的CD25是IL-2的受體,可以有效抑制IL-2的生物學(xué)功能,而IL-2可以促進(jìn)Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖活化[13]。因此,Treg細(xì)胞的這些生物學(xué)功能可能是導(dǎo)致布魯氏菌持續(xù)感染的原因。

    Foxp3是Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)于Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能控制發(fā)揮關(guān)鍵作用[14],該轉(zhuǎn)錄因子已被認(rèn)為是Treg細(xì)胞發(fā)育和功能的主開關(guān)或調(diào)節(jié)器。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Foxp3的mRNA水平在布魯菌病患者特別是慢性患者中明顯高于正常對(duì)照組,說(shuō)明Foxp3在布魯氏菌感染后出現(xiàn)上調(diào),而Foxp3表達(dá)的高低變化代表了Treg細(xì)胞功能的強(qiáng)弱變化[15]。Foxp3通過(guò)直接或間接激活和抑制數(shù)百個(gè)基因來(lái)控制Treg細(xì)胞發(fā)育和發(fā)揮生物學(xué)功能。

    IL-10和TGF-β是Treg細(xì)胞主要釋放的2個(gè)發(fā)揮免疫抑制功能的細(xì)胞因子,以避免機(jī)體產(chǎn)生過(guò)度的免疫反應(yīng)。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)布魯菌病組患者的血漿中的IL-10的水平明顯高于健康對(duì)照組,并且IL-10的增高水平與Treg細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān),這說(shuō)明Treg細(xì)胞增多并上調(diào)IL-10水平來(lái)發(fā)揮抑制功能。Treg細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生IL-10來(lái)發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞的功能。Manuel RZ等[16]曾報(bào)道IL-10在布魯氏菌持續(xù)感染中增高。我們前期也報(bào)道了布魯氏菌感染者血清中TGF-β的水平也顯著增高[17],結(jié)合本文發(fā)現(xiàn)的Treg細(xì)胞比例增加的情況,我們認(rèn)為布魯氏菌感染機(jī)體后,細(xì)菌會(huì)誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答向負(fù)向免疫發(fā)展,進(jìn)而延緩宿主對(duì)布魯氏菌的清除,最終導(dǎo)致布病遷延不愈。

    我國(guó)北方農(nóng)牧地區(qū)布魯氏菌感染者較多,慢性患者眾多。我們的研究顯示Treg功能表達(dá)過(guò)度可能是布魯氏菌發(fā)生持續(xù)感染的原因之一。布魯氏菌感染后出現(xiàn)Treg細(xì)胞數(shù)量增多,F(xiàn)oxp3基因表達(dá)上調(diào)以及IL-10水平增高的現(xiàn)象,這些結(jié)果導(dǎo)致了布魯氏菌免疫應(yīng)答的有害作用。通過(guò)本研究我們認(rèn)為布魯氏菌感染機(jī)體后,布魯氏菌會(huì)誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答向負(fù)向免疫發(fā)展,進(jìn)而延緩宿主對(duì)布魯氏菌的清除,最終導(dǎo)致布病遷延不愈。通過(guò)抑制Treg細(xì)胞或功能的免疫治療手段已經(jīng)嘗試用于腫瘤等疾病的治療[18]。因此,掌握布病持續(xù)感染時(shí)Treg的變化特點(diǎn)、了解Treg在布魯氏菌中的作用,通過(guò)免疫手段抑制或阻斷Treg數(shù)量和功能有望成為布病免疫治療的潛在靶點(diǎn),為控制布魯氏菌持續(xù)感染帶來(lái)新的思路。

    利益沖突:無(wú)

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