職士淇 王滿生 葉鳳凌 陳 龍 張曉婷邱浩楠 何 強(qiáng) 熊夏宇 董 怡
(1. 四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院,四川 成都 610065; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所,湖南 長沙 410205; 3. 農(nóng)業(yè)部麻類生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410205; 4. 中山市第一職業(yè)技術(shù)學(xué)校,廣東 中山 528478)
隨著世界人口的劇增和生活水平的不斷提高,人類對蛋白質(zhì)的需求量也越來越大,積極開發(fā)新的蛋白資源具有重要意義[1-2]。苧麻是中國傳統(tǒng)的纖維作物,生長快、產(chǎn)量高,其葉片約占植株質(zhì)量的40%,苧麻葉還可食用[3]。青葉苧麻(Boehmerianiveavar. tenacissima)是白葉苧麻(BoehmerianiveaL. Gaud.)的變種[4]。孫延煒等[5]研究發(fā)現(xiàn),青葉苧麻嫩莖葉粗蛋白含量比白葉苧麻的高3.75%,而粗纖維比白葉苧麻的低9.57%;其氨基酸含量較豐富,總氨基酸(TAA)和必需氨基酸(EAA)含量分別較白葉苧麻的高20.71%,19.41%,且EAA/TAA為41%>40%,EAA/NEAA為69%>60%,被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)植物蛋白源。此外,由于青葉苧麻葉片沒有白色絨毛,極易被高速刀片打碎而過篩,粉碎機(jī)的生產(chǎn)性能和度電產(chǎn)量也大大提高[6]。
超聲波輔助提取法由于操作簡捷、提取效率高、能維持提取物原有結(jié)構(gòu)和活性等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于輔助植物葉蛋白質(zhì)的提取工藝研究,如桑樹葉蛋白的提取率達(dá)14%左右[7];青豆蛋白的最佳提取率達(dá)42%左右[8];辣木蛋白的最佳提取率為38%左右[9];苧麻品種“中苧2號(hào)”的葉片蛋白質(zhì)提取效率達(dá)11.26%[10]。作為蛋白質(zhì)改性的手段之一,超聲處理還能提高蛋白質(zhì)的部分功能特性[1,11]。根據(jù)蛋白的溶解特性,目前對植物蛋白的提取研究多采用堿溶液、鹽溶液和水為提取劑[7,12]。王滿生等[6]通過堿溶酸沉的方法提取青葉苧麻葉蛋白,其最佳葉蛋白溶出率達(dá)45.27%,最佳酸沉條件下葉蛋白溶出率達(dá)72.65%。
目前苧麻葉多為飼用,苧麻葉蛋白提取及功能特性等相關(guān)研究尚未見報(bào)道。研究擬以青葉苧麻葉片為研究對象,利用超聲波簡捷高效的優(yōu)勢輔助提取青葉苧麻葉蛋白,探究堿溶液、鹽溶液和水對青葉苧麻葉蛋白質(zhì)的提取效果及其乳化性、起泡性等功能特性的影響,以期為青葉苧麻中葉蛋白資源的有效開發(fā)利用提供依據(jù)。
青葉苧麻葉粉:過60目篩,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所南方蛋白飼料植物資源開發(fā)與利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì);
福臨門大豆油:市售;
氯化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甲基紅、溴甲酚綠:分析純,成都科隆化學(xué)品有限公司;
氫氧化鈉、硫酸銅、碘化鉀、硫酸鉀、硼酸、酒石酸鉀鈉、無水乙醇:分析純,成都金山化學(xué)試劑有限公司;
濃硫酸、鹽酸:分析純,西隴化工股份有限公司;
牛血清蛋白(BSA Albumin Fraction V):純度>98%,德國Bio Froxx公司;
離心機(jī):TG-1850型,四川蜀科儀器有限公司;
電子天平:ESJ210-4A型,沈陽龍騰電子有限公司;
多功能微孔板檢測儀:H1M型,美國BioTek Instruments公司;
消化爐:HYP-320型,上海纖檢儀器有限公司;
自動(dòng)型定氮儀:KDN-19F型,上海纖檢儀器有限公司;
可調(diào)高速勻漿機(jī):FSH-2A型,常州潤華電器有限公司。
1.2.1 苧麻葉蛋白的提取 分別采用超聲波輔助堿溶液、鹽溶液和水溶液進(jìn)行提取。提取工藝參照謝藝瀟等[7,12]的方法并適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取1.5 g苧麻粉于不同離心管中,按料液比1∶20(g/mL)分別加入0.1 mmoL/L 的NaOH溶液、5%的NaCl溶液和蒸餾水,振蕩混勻, 150 W下超聲60 min,6 000 r/min離心20 min,取上清液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每種提取液均設(shè)置3個(gè)平行。
1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定 參照周欣悅[13]的方法稍作修改。準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白溶解于蒸餾水中,分別配制成濃度為0.25,0.50,1.00,2.50,5.00,7.50 mg/mL的溶液,與配制好的雙縮脲試劑以1∶4(體積比)混合,避光反應(yīng)30 min,測定540 nm處吸光度,根據(jù)蛋白濃度和吸光度值計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.027 0X+0.099 2(R2=0.998 9)。
分別取適量堿提、鹽提、水提取的苧麻葉蛋白質(zhì)溶液,用對應(yīng)提取劑稀釋1倍,與雙縮脲試劑以1∶4(體積比)混合,避光反應(yīng)30 min,測定540 nm處吸光度,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算溶液中蛋白質(zhì)濃度。
1.2.3 氮溶解指數(shù)(NSI)的測定 參照楊希娟等[14]的方法稍加修改。準(zhǔn)確稱取苧麻粉末樣品0.5 g,共12份,其中3份不作任何處理,另外9份按1.2.2的方法進(jìn)行蛋白提取,將提取后的殘?jiān)?10 ℃下烘干,于消化管中將12份樣品分別與3.0 g硫酸鉀、0.2 g硫酸銅和20 mL濃硫酸混合,另取3支消化管分別加入3.0 g硫酸鉀、0.2 g硫酸銅、20 mL濃硫酸作空白試驗(yàn)。樣品消化程序:200 ℃ 10 min,420 ℃ 120 min。分別取50 mL 2%的硼酸溶液和3滴甲基紅溴甲酚綠混合指示劑于250 mL錐形瓶,消化結(jié)束后待消化管冷卻至室溫,用自動(dòng)型定氮儀進(jìn)行定氮,用0.1 mol/L鹽酸溶液滴定。按式(1)計(jì)算氮溶解指數(shù)。
(1)
式中:
NSI——氮溶解指數(shù),%;
P1——提取后殘?jiān)写值鞍缀?,g;
P——苧麻粉末樣品中粗蛋白含量,g。
1.2.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定 參照王一博等[15-16]的方法稍加修改。分別將堿提、鹽提、水提蛋白溶液稀釋至蛋白質(zhì)含量為2 mg/mL,取稀釋后的溶液20 mL,10 000 r/min高速攪打2 min,然后迅速倒入量筒中,記錄上層泡沫體積和攪拌停止時(shí)蛋白質(zhì)溶液體積,靜置30 min后,再次記錄上層泡沫的體積,分別按式(2)、(3)計(jì)算起泡性及泡沫穩(wěn)定性。
(2)
(3)
式中:
FP——起泡性,%;
SF——泡沫穩(wěn)定性,%;
V0——攪拌停止時(shí)上層泡沫體積,mL;
V1——攪拌停止30 min后泡沫體積,mL;
V2——攪拌停止時(shí)蛋白質(zhì)溶液體積,mL。
1.2.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定 參照葉鳳凌等[17-18]的方法稍加修改。取3 mL大豆油和9 mL已用對應(yīng)提取溶劑稀釋至2 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液于50 mL塑料離心管內(nèi)混合,10 000 r/min均質(zhì)2 min,分別在0,30 min時(shí)從離心管底部5 mm處取16 μL乳狀液與4 mL 0.1%的SDS溶液混勻,測定500 nm處吸光值。分別按式(4)、(5)計(jì)算乳化性及乳化穩(wěn)定性[19]。
(4)
(5)
式中:
EP——乳化性,m2/g;
SE——乳化穩(wěn)定性;
D——稀釋倍數(shù),取125;
c——蛋白溶液中蛋白質(zhì)濃度,g/mL;
φ——乳化液中油相的體積分?jǐn)?shù),取0.25;
A0、A30——0,30 min時(shí)的吸光值;
Δt——兩次檢測的間隔時(shí)間。
每組試驗(yàn)重復(fù)3次,采用Office 2019、SPSS 19.0等軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。
由圖1可知,堿提、鹽提和水提得到的蛋白質(zhì)量濃度分別為9.99,10.73,9.53 mg/mL,說明鹽提法得到的蛋白含量最高,堿提法次之,水提法最低。這主要是因?yàn)橹行喳}中和了蛋白質(zhì)表面的電荷并破壞了水化膜,使蛋白凝集沉淀,且蛋白質(zhì)提取過程中低濃度中性鹽還可增加水的極性,進(jìn)而使更多的蛋白質(zhì)溶解至溶液中,最終提高了蛋白質(zhì)提取率[20]。
由圖2可知,水提法、鹽提法和堿提法的氮溶解指數(shù)分別為56.96%,61.95%,55.09%,即鹽提法>水提法>堿提法,與雙縮脲法檢測的蛋白提取液中蛋白含量的結(jié)果趨勢相吻合。水提法和堿提法的青葉苧麻葉蛋白溶液的NSI值<60.00%,而鹽提法的蛋白溶液的NSI值略>60.00%,說明這3種方法均不能完全提取出青葉苧麻原料中的蛋白質(zhì),可能與植物蛋白組分有關(guān)。植物蛋白多含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麥谷蛋白和殘?jiān)鞍祝渲星虻鞍自邴}溶液中溶解性較好,易被鹽提溶出;清蛋白可被蒸餾水提?。畸湽鹊鞍卓捎脡A性溶液提取[20],因此推測青葉苧麻葉片中球蛋白含量較高。此外,提取原料中蛋白質(zhì)含量過高會(huì)影響蛋白提取率,如高蛋白豆粕提取后的殘?jiān)鞍酌黠@高于低蛋白豆粕,且更高的蛋白含量會(huì)導(dǎo)致分離蛋白提取率有所降低[21]。青葉苧麻葉粉中蛋白質(zhì)含量約為28.89%,屬于高蛋白含量植物,故測得的樣品NSI值較低,符合上述原因分析。
圖1 提取方法對蛋白質(zhì)溶液濃度的影響
由圖3可知,相比于10 mg/mL濃度條件下的大豆分離蛋白的起泡性只有10%[22],青葉苧麻蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更佳的起泡性,且鹽提法蛋白質(zhì)溶液的起泡性及泡沫穩(wěn)定性均較佳。這可能是由于NaCl溶液可以與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用,影響蛋白質(zhì)的黏度、展開和聚集,進(jìn)而對起泡性產(chǎn)生一定的影響[23]。同時(shí),一定量的NaCl所提供的離子環(huán)境還可以增大蛋白質(zhì)的溶解度,降低在氣—液界面上未吸附蛋白質(zhì)與吸附蛋白質(zhì)之間的排斥力,有助于蛋白質(zhì)吸附在泡沫的界面上而防止泡沫粗化,從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)溶液的起泡性和泡沫穩(wěn)定性[24]。
由圖3還可知,相比于水提法,堿提法蛋白質(zhì)溶液的起泡性稍差,但其泡沫穩(wěn)定性稍好,可能是水提法溶液的pH值更接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),由于缺乏在界面和吸附分子之間的排斥力,被吸附到界面上的蛋白質(zhì)數(shù)量增加,提高了蛋白質(zhì)的起泡性,而堿提法的pH值略高,排斥作用降低,促進(jìn)界面上蛋白質(zhì)之間的相互作用形成黏度較大的膜,從而表現(xiàn)得更加穩(wěn)定[25-26]。
由圖4可知,3種蛋白質(zhì)溶液的乳化性分別為5.89,5.27,11.17 m2/g,其中水提法蛋白質(zhì)的乳化性效果最好,而鹽提法的乳化性效果不佳。3種蛋白質(zhì)溶液的乳化穩(wěn)定性分別為231.92,114.26,145.65。由于蛋白質(zhì)的乳化性受溶解性和表面活性兩個(gè)因素影響,堿提法的蛋白質(zhì)提取液pH值有所升高,遠(yuǎn)離等電點(diǎn),而遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度增大,參與乳化作用的蛋白質(zhì)也隨之增多,因此堿提法蛋白質(zhì)溶液有較好的乳化性及乳化穩(wěn)定性[27]。而鹽提法蛋白質(zhì)溶液,其乳化性和乳化穩(wěn)定性均比另外兩種提取方法有一定程度的降低,這一情況與鄧塔等[28]的結(jié)果類似。這可能是鹽溶液中的離子破壞了乳狀液中液滴表面電荷平衡,液滴間無法保持平衡,乳化穩(wěn)定性減小。當(dāng)食鹽濃度≥0.5 mol/L時(shí),可能會(huì)促進(jìn)脂肪之間的加速融合,從而降低蛋白質(zhì)溶液的乳化穩(wěn)定性[29]。
圖2 提取方法對NSI值的影響
圖3 提取方法對蛋白質(zhì)起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響
圖4 提取方法對蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響
研究了超聲波輔助堿溶液、鹽溶液和水對青葉苧麻葉蛋白的提取效果。結(jié)果表明,低濃度的中性鹽溶液可增加水的極性,從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解并提高其提取率,根據(jù)植物蛋白組分的溶解特性,推測青葉苧麻葉片中球蛋白含量較高。青葉苧麻葉蛋白含量約為28.89%,3種溶劑提取的蛋白質(zhì)的氮溶指數(shù)均較低,且鹽提法(61.95%)>水提法(56.96%)>堿提法(55.09%)。3種提取法的青葉苧麻葉蛋白的起泡性均優(yōu)于10 mg/mL濃度條件下的大豆分離蛋白的起泡性(10%),且鹽提法的青葉苧麻葉蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性均優(yōu)于其他兩種提取方法。后續(xù)可進(jìn)一步明確青葉苧麻葉蛋白組分的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì),為青葉苧麻葉的開發(fā)利用提供更多的理論依據(jù)。