提取方法對青葉苧麻葉蛋白功能特性的影響

職士淇 王滿生 葉鳳凌 陳 龍 張曉婷邱浩楠 何 強(qiáng) 熊夏宇 董 怡

(1. 四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205; 3. 農(nóng)業(yè)部麻類生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410205; 4. 中山市第一職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 中山 528478)

隨著世界人口的劇增和生活水平的不斷提高，人類對蛋白質(zhì)的需求量也越來越大，積極開發(fā)新的蛋白資源具有重要意義[1-2]。苧麻是中國傳統(tǒng)的纖維作物，生長快、產(chǎn)量高，其葉片約占植株質(zhì)量的40%，苧麻葉還可食用[3]。青葉苧麻(Boehmerianiveavar. tenacissima)是白葉苧麻(BoehmerianiveaL. Gaud.)的變種[4]。孫延煒等[5]研究發(fā)現(xiàn)，青葉苧麻嫩莖葉粗蛋白含量比白葉苧麻的高3.75%，而粗纖維比白葉苧麻的低9.57%；其氨基酸含量較豐富，總氨基酸(TAA)和必需氨基酸(EAA)含量分別較白葉苧麻的高20.71%，19.41%，且EAA/TAA為41%>40%，EAA/NEAA為69%>60%，被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)植物蛋白源。此外，由于青葉苧麻葉片沒有白色絨毛，極易被高速刀片打碎而過篩，粉碎機(jī)的生產(chǎn)性能和度電產(chǎn)量也大大提高[6]。

超聲波輔助提取法由于操作簡捷、提取效率高、能維持提取物原有結(jié)構(gòu)和活性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于輔助植物葉蛋白質(zhì)的提取工藝研究，如桑樹葉蛋白的提取率達(dá)14%左右[7]；青豆蛋白的最佳提取率達(dá)42%左右[8]；辣木蛋白的最佳提取率為38%左右[9]；苧麻品種“中苧2號(hào)”的葉片蛋白質(zhì)提取效率達(dá)11.26%[10]。作為蛋白質(zhì)改性的手段之一，超聲處理還能提高蛋白質(zhì)的部分功能特性[1,11]。根據(jù)蛋白的溶解特性，目前對植物蛋白的提取研究多采用堿溶液、鹽溶液和水為提取劑[7,12]。王滿生等[6]通過堿溶酸沉的方法提取青葉苧麻葉蛋白，其最佳葉蛋白溶出率達(dá)45.27%，最佳酸沉條件下葉蛋白溶出率達(dá)72.65%。

目前苧麻葉多為飼用，苧麻葉蛋白提取及功能特性等相關(guān)研究尚未見報(bào)道。研究擬以青葉苧麻葉片為研究對象，利用超聲波簡捷高效的優(yōu)勢輔助提取青葉苧麻葉蛋白，探究堿溶液、鹽溶液和水對青葉苧麻葉蛋白質(zhì)的提取效果及其乳化性、起泡性等功能特性的影響，以期為青葉苧麻中葉蛋白資源的有效開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青葉苧麻葉粉：過60目篩，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所南方蛋白飼料植物資源開發(fā)與利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)；

福臨門大豆油：市售；

氯化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甲基紅、溴甲酚綠：分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司；

氫氧化鈉、硫酸銅、碘化鉀、硫酸鉀、硼酸、酒石酸鉀鈉、無水乙醇：分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；

濃硫酸、鹽酸：分析純，西隴化工股份有限公司；

牛血清蛋白(BSA Albumin Fraction V)：純度>98%，德國Bio Froxx公司；

離心機(jī)：TG-1850型，四川蜀科儀器有限公司；

電子天平：ESJ210-4A型，沈陽龍騰電子有限公司；

多功能微孔板檢測儀：H1M型，美國BioTek Instruments公司；

消化爐：HYP-320型，上海纖檢儀器有限公司；

自動(dòng)型定氮儀：KDN-19F型，上海纖檢儀器有限公司；

可調(diào)高速勻漿機(jī)：FSH-2A型，常州潤華電器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苧麻葉蛋白的提取 分別采用超聲波輔助堿溶液、鹽溶液和水溶液進(jìn)行提取。提取工藝參照謝藝瀟等[7,12]的方法并適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取1.5 g苧麻粉于不同離心管中，按料液比1∶20(g/mL)分別加入0.1 mmoL/L 的NaOH溶液、5%的NaCl溶液和蒸餾水，振蕩混勻， 150 W下超聲60 min，6 000 r/min離心20 min，取上清液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每種提取液均設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定 參照周欣悅[13]的方法稍作修改。準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白溶解于蒸餾水中，分別配制成濃度為0.25，0.50，1.00，2.50，5.00，7.50 mg/mL的溶液，與配制好的雙縮脲試劑以1∶4(體積比)混合，避光反應(yīng)30 min，測定540 nm處吸光度，根據(jù)蛋白濃度和吸光度值計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.027 0X+0.099 2(R2=0.998 9)。

分別取適量堿提、鹽提、水提取的苧麻葉蛋白質(zhì)溶液，用對應(yīng)提取劑稀釋1倍，與雙縮脲試劑以1∶4(體積比)混合，避光反應(yīng)30 min，測定540 nm處吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算溶液中蛋白質(zhì)濃度。

1.2.3 氮溶解指數(shù)(NSI)的測定 參照楊希娟等[14]的方法稍加修改。準(zhǔn)確稱取苧麻粉末樣品0.5 g，共12份，其中3份不作任何處理，另外9份按1.2.2的方法進(jìn)行蛋白提取，將提取后的殘?jiān)?10 ℃下烘干，于消化管中將12份樣品分別與3.0 g硫酸鉀、0.2 g硫酸銅和20 mL濃硫酸混合，另取3支消化管分別加入3.0 g硫酸鉀、0.2 g硫酸銅、20 mL濃硫酸作空白試驗(yàn)。樣品消化程序：200 ℃ 10 min，420 ℃ 120 min。分別取50 mL 2%的硼酸溶液和3滴甲基紅溴甲酚綠混合指示劑于250 mL錐形瓶，消化結(jié)束后待消化管冷卻至室溫，用自動(dòng)型定氮儀進(jìn)行定氮，用0.1 mol/L鹽酸溶液滴定。按式(1)計(jì)算氮溶解指數(shù)。

(1)

式中：

NSI——氮溶解指數(shù)，%；

P1——提取后殘?jiān)写值鞍缀?，g；

P——苧麻粉末樣品中粗蛋白含量，g。

1.2.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定 參照王一博等[15-16]的方法稍加修改。分別將堿提、鹽提、水提蛋白溶液稀釋至蛋白質(zhì)含量為2 mg/mL，取稀釋后的溶液20 mL，10 000 r/min高速攪打2 min，然后迅速倒入量筒中，記錄上層泡沫體積和攪拌停止時(shí)蛋白質(zhì)溶液體積，靜置30 min后，再次記錄上層泡沫的體積，分別按式(2)、(3)計(jì)算起泡性及泡沫穩(wěn)定性。

(2)

(3)

式中：

FP——起泡性，%；

SF——泡沫穩(wěn)定性，%；

V0——攪拌停止時(shí)上層泡沫體積，mL；

V1——攪拌停止30 min后泡沫體積，mL；

V2——攪拌停止時(shí)蛋白質(zhì)溶液體積，mL。

1.2.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定 參照葉鳳凌等[17-18]的方法稍加修改。取3 mL大豆油和9 mL已用對應(yīng)提取溶劑稀釋至2 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液于50 mL塑料離心管內(nèi)混合，10 000 r/min均質(zhì)2 min，分別在0，30 min時(shí)從離心管底部5 mm處取16 μL乳狀液與4 mL 0.1%的SDS溶液混勻，測定500 nm處吸光值。分別按式(4)、(5)計(jì)算乳化性及乳化穩(wěn)定性[19]。

(4)

(5)

式中：

EP——乳化性，m2/g；

SE——乳化穩(wěn)定性；

D——稀釋倍數(shù)，取125；

c——蛋白溶液中蛋白質(zhì)濃度，g/mL；

φ——乳化液中油相的體積分?jǐn)?shù)，取0.25；

A0、A30——0，30 min時(shí)的吸光值；

Δt——兩次檢測的間隔時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Office 2019、SPSS 19.0等軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 對蛋白質(zhì)溶液濃度的影響

由圖1可知，堿提、鹽提和水提得到的蛋白質(zhì)量濃度分別為9.99，10.73，9.53 mg/mL，說明鹽提法得到的蛋白含量最高，堿提法次之，水提法最低。這主要是因?yàn)橹行喳}中和了蛋白質(zhì)表面的電荷并破壞了水化膜，使蛋白凝集沉淀，且蛋白質(zhì)提取過程中低濃度中性鹽還可增加水的極性，進(jìn)而使更多的蛋白質(zhì)溶解至溶液中，最終提高了蛋白質(zhì)提取率[20]。

2.2 對氮溶解指數(shù)的影響

由圖2可知，水提法、鹽提法和堿提法的氮溶解指數(shù)分別為56.96%，61.95%，55.09%，即鹽提法>水提法>堿提法，與雙縮脲法檢測的蛋白提取液中蛋白含量的結(jié)果趨勢相吻合。水提法和堿提法的青葉苧麻葉蛋白溶液的NSI值<60.00%，而鹽提法的蛋白溶液的NSI值略>60.00%，說明這3種方法均不能完全提取出青葉苧麻原料中的蛋白質(zhì)，可能與植物蛋白組分有關(guān)。植物蛋白多含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麥谷蛋白和殘?jiān)鞍祝渲星虻鞍自邴}溶液中溶解性較好，易被鹽提溶出；清蛋白可被蒸餾水提?。畸湽鹊鞍卓捎脡A性溶液提取[20]，因此推測青葉苧麻葉片中球蛋白含量較高。此外，提取原料中蛋白質(zhì)含量過高會(huì)影響蛋白提取率，如高蛋白豆粕提取后的殘?jiān)鞍酌黠@高于低蛋白豆粕，且更高的蛋白含量會(huì)導(dǎo)致分離蛋白提取率有所降低[21]。青葉苧麻葉粉中蛋白質(zhì)含量約為28.89%，屬于高蛋白含量植物，故測得的樣品NSI值較低,符合上述原因分析。

圖1 提取方法對蛋白質(zhì)溶液濃度的影響

2.3 對起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，相比于10 mg/mL濃度條件下的大豆分離蛋白的起泡性只有10%[22]，青葉苧麻蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更佳的起泡性，且鹽提法蛋白質(zhì)溶液的起泡性及泡沫穩(wěn)定性均較佳。這可能是由于NaCl溶液可以與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，影響蛋白質(zhì)的黏度、展開和聚集，進(jìn)而對起泡性產(chǎn)生一定的影響[23]。同時(shí)，一定量的NaCl所提供的離子環(huán)境還可以增大蛋白質(zhì)的溶解度，降低在氣—液界面上未吸附蛋白質(zhì)與吸附蛋白質(zhì)之間的排斥力，有助于蛋白質(zhì)吸附在泡沫的界面上而防止泡沫粗化，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)溶液的起泡性和泡沫穩(wěn)定性[24]。

由圖3還可知，相比于水提法，堿提法蛋白質(zhì)溶液的起泡性稍差，但其泡沫穩(wěn)定性稍好，可能是水提法溶液的pH值更接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，由于缺乏在界面和吸附分子之間的排斥力，被吸附到界面上的蛋白質(zhì)數(shù)量增加，提高了蛋白質(zhì)的起泡性，而堿提法的pH值略高，排斥作用降低，促進(jìn)界面上蛋白質(zhì)之間的相互作用形成黏度較大的膜，從而表現(xiàn)得更加穩(wěn)定[25-26]。

2.4 對乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，3種蛋白質(zhì)溶液的乳化性分別為5.89，5.27，11.17 m2/g，其中水提法蛋白質(zhì)的乳化性效果最好，而鹽提法的乳化性效果不佳。3種蛋白質(zhì)溶液的乳化穩(wěn)定性分別為231.92，114.26，145.65。由于蛋白質(zhì)的乳化性受溶解性和表面活性兩個(gè)因素影響，堿提法的蛋白質(zhì)提取液pH值有所升高，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，而遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度增大，參與乳化作用的蛋白質(zhì)也隨之增多，因此堿提法蛋白質(zhì)溶液有較好的乳化性及乳化穩(wěn)定性[27]。而鹽提法蛋白質(zhì)溶液，其乳化性和乳化穩(wěn)定性均比另外兩種提取方法有一定程度的降低，這一情況與鄧塔等[28]的結(jié)果類似。這可能是鹽溶液中的離子破壞了乳狀液中液滴表面電荷平衡，液滴間無法保持平衡，乳化穩(wěn)定性減小。當(dāng)食鹽濃度≥0.5 mol/L時(shí)，可能會(huì)促進(jìn)脂肪之間的加速融合，從而降低蛋白質(zhì)溶液的乳化穩(wěn)定性[29]。

圖2 提取方法對NSI值的影響

圖3 提取方法對蛋白質(zhì)起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

圖4 提取方法對蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

研究了超聲波輔助堿溶液、鹽溶液和水對青葉苧麻葉蛋白的提取效果。結(jié)果表明，低濃度的中性鹽溶液可增加水的極性，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解并提高其提取率，根據(jù)植物蛋白組分的溶解特性，推測青葉苧麻葉片中球蛋白含量較高。青葉苧麻葉蛋白含量約為28.89%，3種溶劑提取的蛋白質(zhì)的氮溶指數(shù)均較低，且鹽提法(61.95%)>水提法(56.96%)>堿提法(55.09%)。3種提取法的青葉苧麻葉蛋白的起泡性均優(yōu)于10 mg/mL濃度條件下的大豆分離蛋白的起泡性(10%)，且鹽提法的青葉苧麻葉蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性均優(yōu)于其他兩種提取方法。后續(xù)可進(jìn)一步明確青葉苧麻葉蛋白組分的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，為青葉苧麻葉的開發(fā)利用提供更多的理論依據(jù)。