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    大孔樹(shù)脂分離純化霍山石斛多酚及其抗氧化活性研究

    2020-12-07 09:39:02陳明威陶良凡錢(qián)森和
    食品與機(jī)械 2020年11期
    關(guān)鍵詞:霍山超氧酚類(lèi)

    陳明威 魏 明 陶良凡 錢(qián)森和

    (安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241000)

    霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)俗稱(chēng)米斛,為蘭科石斛屬植物,是珍稀藥用植物,具有滋陰養(yǎng)胃、清音明目和養(yǎng)顏駐容等功效[1]。大量研究[2-5]表明,石斛含有多糖、石斛堿和酚類(lèi)物質(zhì)等有效成分,具有抗癌、抗白內(nèi)障、抗氧化、降血糖等作用。酚類(lèi)物質(zhì)是植物的次生代謝產(chǎn)物,具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等活性[6-7]。目前,對(duì)石斛多糖、石斛堿等活性成分研究較多,但對(duì)石斛中酚類(lèi)物質(zhì)的研究較少。

    石斛中含有大量酚類(lèi)物質(zhì)。體外試驗(yàn)表明,石斛中的酚類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性[8-10]。目前已從霍山石斛[10]、鐵皮石斛[9]和金釵石斛[8]中提取了石斛粗多酚酚類(lèi)物質(zhì),粗多酚含有糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等成分,這些成分對(duì)其活性研究會(huì)造成干擾。植物多酚的分離純化常用的方法有溶劑萃取、離子沉淀、膜分離、超臨界萃取和層析分離等。其中大孔樹(shù)脂具有良好的選擇性、吸附量大、操作簡(jiǎn)便且成本低等特點(diǎn),被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離[11]。目前,利用大孔樹(shù)脂分離純化霍山石斛多酚還未見(jiàn)報(bào)道。

    樹(shù)脂極性、顆粒大小以及表面積大小均能影響酚類(lèi)物質(zhì)的分離效果[12]。研究擬以霍山石斛粗多酚為原料,通過(guò)比較不同樹(shù)脂對(duì)石斛中酚類(lèi)物質(zhì)吸附和解吸特性,篩選適合的樹(shù)脂,優(yōu)化分離工藝參數(shù),并探討多酚的抗氧化性,旨在為石斛多酚的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定以及功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    霍山石斛:安徽工程大學(xué)組培室;

    D101型、AB-8型、HZ-841型、NKA-9型、ADS-7型大孔樹(shù)脂:鄭州和成新材料科技有限公司;

    L-抗壞血酸、鐵氰化鉀、磷酸緩沖液、三氯化鐵、Tris-HCl、鄰苯三酚、三氯甲烷、無(wú)水乙醇、無(wú)水碳酸鈉、鹽酸和氫氧化鈉:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

    Folin-Ciocalteau酚試劑:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

    沒(méi)食子酸:分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司。

    1.2 儀器設(shè)備

    電子天平:ZA2204B型,上海佑科儀器儀表有限公司;

    循環(huán)水式多用真空泵:SHB-ⅢS型,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;

    紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):UV745型,上海光譜儀器有限公司;

    旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:RE52-AA型,上海亞榮生化儀器廠;

    高速冷凍離心機(jī):TGL-16M型,湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;

    恒流泵:BT1-100型,上海琪特分析儀器有限公司;

    自動(dòng)部分收集器:BSZ-100型,上海琪特分析儀器有限公司;

    真空冷凍干燥機(jī):LGJ型,北京松源華興科技發(fā)展有限公司;

    高效液相色譜儀:LC-20A型,日本島津公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 霍山石斛粗多酚的制備 霍山石斛鮮條研磨后,用蒸餾水以料液比m料∶m水=1∶60 (g/mL)、提取溫度60 ℃條件下浸提40 min,抽濾后濃縮,濃縮液用80%乙醇溶液醇沉除去多糖、蛋白,抽濾,取上清液濃縮后備用。

    1.3.2 多酚的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[13]。以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),沒(méi)食子酸與福林酚試劑在堿性條件下反應(yīng)后的吸光度(A765 nm)為縱坐標(biāo),建立沒(méi)食子酸濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:Y=9.36X+0.004 2,R2=0.999 3。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其多酚類(lèi)化合物質(zhì)量濃度。

    1.3.3 大孔樹(shù)脂的篩選 所有樹(shù)脂在使用前參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行預(yù)處理。分別稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理后的D101、AB-8、HZ-841、NKA-9、ADS-7型大孔樹(shù)脂各1.0 g于100 mL 錐形瓶中,加入15 mL濃度為2.0 mg/mL的霍山石斛多酚粗提液,在25 ℃,120 r/min恒溫振蕩?kù)o態(tài)吸附4 h,然后吸取上清液測(cè)定多酚的量,并計(jì)算其吸附量和吸附率。將吸附飽和的大孔樹(shù)脂過(guò)濾,然后放入到三角瓶中,加入50%的乙醇15 mL,用保鮮膜將錐形瓶瓶口封住避免乙醇揮發(fā),放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱在25 ℃,120 r/min 條件下振蕩解吸4 h,然后吸取上清液測(cè)定多酚的量,并計(jì)算解吸率。通過(guò)不同樹(shù)脂的吸附率和解吸率確定適合的樹(shù)脂。

    (1)

    (2)

    (3)

    式中:

    Q——大孔樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附量,mg/g;

    R1——大孔樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附率,%;

    R2——洗脫液對(duì)大孔樹(shù)脂中多酚的解吸率,%;

    C0——多酚初始濃度,mg/mL;

    C1——靜態(tài)吸附完全后上清液中多酚的濃度,mg/mL;

    C2——解吸完全后乙醇溶液中的多酚濃度,mg/mL;

    V——加入的多酚溶液體積,mL;

    m——錐形瓶中加入大孔樹(shù)脂的質(zhì)量,g。

    1.3.4 靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

    (1) 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn):分別稱(chēng)取AB-8型大孔樹(shù)脂1.0 g于6個(gè)100 mL的錐形瓶中,各加入多酚粗提液15 mL,每30 min測(cè)定一次上清液中多酚的濃度,計(jì)算其吸附量、吸附率。

    (2) 多酚樣品濃度對(duì)吸附量的影響:分別稱(chēng)取AB-8型大孔樹(shù)脂1.0 g于6個(gè)100 mL的錐形瓶中,依次加入0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mg/mL的多酚粗提液15 mL,在25 ℃,120 r/min恒溫震蕩?kù)o態(tài)吸附150 min,然后測(cè)定多酚含量,并計(jì)算其吸附量和吸附率。

    (3) 樣品pH對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響:分別稱(chēng)取AB-8型大孔樹(shù)脂1.0 g于6個(gè)100 mL的錐形瓶中,依次加入15 mL的不同pH的多酚粗提液(pH 3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0),在25 ℃,120 r/min恒溫震蕩?kù)o態(tài)150 min,然后測(cè)定多酚含量,并計(jì)算其吸附量和吸附率。

    (4) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)解吸率的影響:按上述最佳條件吸附多酚至飽和,并計(jì)算其吸附量,然后抽濾,分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%,20%,30%,40%,50%,60%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫,測(cè)定上清液中多酚含量,計(jì)算其解吸率。

    1.3.5 動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

    (1) 上樣流速對(duì)大孔樹(shù)脂吸附量的影響:將經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的AB-8型大孔樹(shù)脂填充到1.6 cm×60 cm的色譜柱中,填充后樹(shù)脂床直徑為1.6 cm,高50 cm。平衡后,多酚的濃度為2.0 mg/mL,分別以1.0,2.0,3.0,4.0 mL/min的流速進(jìn)行上樣吸附,收集流出液,每一管4 mL,測(cè)定流出液的體積和多酚濃度。檢測(cè)流出液中多酚的泄漏量,泄漏量達(dá)到進(jìn)樣濃度的10%為吸附終點(diǎn),計(jì)算其最大吸附量。

    (2) 乙醇流速對(duì)大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)洗脫的影響:吸附飽和的AB-8大孔樹(shù)脂,用50%的乙醇溶液分別以1.0,2.0,3.0,4.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,每一管4 mL,測(cè)定流出液的體積和多酚濃度,并計(jì)算解吸率。

    1.3.6 AB-8型大孔樹(shù)脂梯度洗脫

    (1) 將經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的AB-8型大孔樹(shù)脂填充到1.6 cm×60 cm的色譜柱中,按上述條件,對(duì)霍山石斛多酚進(jìn)行上樣處理,再用蒸餾水洗脫,洗去粗多酚中殘留的還原糖等雜質(zhì),之后用乙醇進(jìn)行梯度洗脫,洗脫梯度設(shè)置10%為一個(gè)梯度,收集并測(cè)定流出液多酚的濃度,直至霍山石斛多酚洗脫完全。

    (2) 梯度洗脫組分高效液相色譜分析:Zorbox SB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱箱溫度30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;進(jìn)樣量 10 μL。流動(dòng)相A為100%甲醇,流動(dòng)相B為0.2%乙酸水溶液;流速1 mL/min。梯度洗脫條件為:0~8 min流動(dòng)相A 5%~8%,8~12 min流動(dòng)相A 8%~15%,12~17 min流動(dòng)相A 15%~22%,17~25 min 流動(dòng)相A 22%~50%,25~33 min流動(dòng)相A 50%~60%,33~50 min流動(dòng)相A 60%~5%,總的運(yùn)行時(shí)間51 min。

    1.3.7 霍山石斛多酚的體外抗氧化試驗(yàn)

    (1) 超氧陰離子清除能力測(cè)定:參照文獻(xiàn)[15],按式(4) 計(jì)算超氧陰離子的清除率。

    (4)

    式中:

    Q1——超氧陰離子的清除率,%;

    A1——三(羧甲基)氨基甲烷+樣品+鄰苯三酚+鹽酸的吸光度;

    A2——三(羧甲基)氨基甲烷+樣品+鹽酸的吸光度;

    A3——三(羧甲基)氨基甲烷+鄰苯三酚+鹽酸的吸光度。

    (2) 總還原力測(cè)定:參照文獻(xiàn)[16],按式(5)計(jì)算總還原力。

    A0=A1-A2,

    (5)

    式中:

    A0——樣品的總還原力;

    A1——樣品+磷酸鹽緩沖液+鐵氰化鉀+三氯乙酸+三氯化鐵的吸光度;

    A2——蒸餾水+磷酸鹽緩沖液+鐵氰化鉀+三氯乙酸+三氯化鐵的吸光度。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并比較所得數(shù)據(jù)之間的顯著差異性(P<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大孔樹(shù)脂的篩選

    如表1所示,5種大孔樹(shù)脂對(duì)石斛多酚具有較強(qiáng)的吸附能力,弱極性大孔樹(shù)脂AB-8和HZ-841型對(duì)石斛多酚的吸附量較高,隨著樹(shù)脂極性的增強(qiáng),其吸附率有所下降,說(shuō)明大孔樹(shù)脂對(duì)石斛多酚具有較好的選擇性。大部分的樹(shù)脂解吸率較高,其中AB-8樹(shù)脂解吸率達(dá)到94.08%。綜合各型號(hào)樹(shù)脂的吸附—解吸結(jié)果,選用AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)霍山石斛多酚進(jìn)行純化。

    2.2 靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

    2.2.1 AB-8大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附霍山石斛多酚的動(dòng)力學(xué)

    由圖1可知,大孔樹(shù)脂對(duì)霍山石斛多酚的吸附量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在30~150 min時(shí),大孔樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附量逐漸增加,在150 min時(shí)吸附量達(dá)到最大,說(shuō)明在該時(shí)間段內(nèi),樹(shù)脂對(duì)多酚類(lèi)的吸附仍處在持續(xù)進(jìn)行的狀態(tài),在150 min之后繼續(xù)吸附,吸附量不再增加,說(shuō)明大孔樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附已經(jīng)達(dá)到飽和。

    2.2.2 pH對(duì)大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響 多酚類(lèi)化合物含有羥基[17],pH值影響酚類(lèi)物質(zhì)在溶液中的狀態(tài),進(jìn)而影響其與溶劑間的作用。如圖2所示,在一定pH值范圍內(nèi),隨著pH值的增大,大孔樹(shù)脂的吸附量呈增長(zhǎng)趨勢(shì),當(dāng)pH>4時(shí),大孔樹(shù)脂的吸附量逐漸降低。這是由于在弱酸性環(huán)境下,多酚類(lèi)化合物以分子狀態(tài)存在,而當(dāng)pH值過(guò)高時(shí),加速了酚羥基電離,產(chǎn)生了相應(yīng)的陰離子,導(dǎo)致酚類(lèi)物質(zhì)與大孔樹(shù)脂間的氫鍵作用減弱,從而降低了大孔樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附能力,導(dǎo)致吸附量減少[18]。

    表1 大孔樹(shù)脂型號(hào)對(duì)石斛多酚的靜態(tài)吸附和解吸的影響

    圖1 AB-8樹(shù)脂吸附霍山石斛多酚的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

    2.2.3 多酚濃度對(duì)大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響 如圖3所示,多酚濃度對(duì)樹(shù)脂吸附性能具有顯著影響,當(dāng)多酚濃度為0.5~2.0 mg/mL時(shí),隨著多酚濃度的增加,AB-8樹(shù)脂吸附能力增強(qiáng)。這可能因?yàn)樵谝欢舛认?,大孔?shù)脂更有利于與酚類(lèi)化合物分子接觸,從而能夠吸附更多的酚類(lèi)化合物。而當(dāng)多酚濃度>2.0 mg/mL時(shí),隨著多酚濃度的增加,大孔樹(shù)脂的吸附量反而減少,這是由于當(dāng)溶液中酚類(lèi)化合物濃度過(guò)高,酚類(lèi)化合物分子間相互作用產(chǎn)生絮凝現(xiàn)象,阻塞樹(shù)脂孔洞,不利于樹(shù)脂對(duì)酚類(lèi)化合物的吸附,因此,多酚濃度為2.0 mg/mL較為適宜。

    2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AB-8大孔樹(shù)脂靜態(tài)解吸霍山石斛多酚的影響 由圖4可知,乙醇溶液可從AB-8樹(shù)脂中有效地將霍山石斛多酚解吸出來(lái),且其對(duì)霍山石斛多酚的解吸性能與乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)有關(guān),隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增長(zhǎng),其對(duì)霍山石斛多酚的解吸率亦呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì),當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí),對(duì)霍山石斛多酚的解吸率最大為94.56%,繼續(xù)增大乙醇溶劑的體積分?jǐn)?shù),解吸率略有降低。這是因?yàn)橐掖既芤旱捏w積分?jǐn)?shù)較低時(shí),其相對(duì)極性較強(qiáng),解吸率較低,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí),極性較為適中,解吸率最高;隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,極性降低,解吸率又有所下降。

    圖2 樣品pH值對(duì)AB-8樹(shù)脂吸附能力的影響

    圖3 樣品濃度對(duì)大孔樹(shù)脂吸附能力的影響

    2.3 動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

    2.3.1 上樣流速對(duì)大孔樹(shù)脂吸附性能的影響 如圖5所示,上樣流速對(duì)AB-8吸附多酚影響較大,當(dāng)上樣濃度一定時(shí),隨著上樣流速的增大,則泄漏點(diǎn)出現(xiàn)得越早。當(dāng)上樣流速分別為1.0,2.0,3.0,4.0 mL/min時(shí),泄漏點(diǎn)分別出現(xiàn)在276,260,248,236 mL附近。此時(shí)的吸附量分別為537.83,507.05,482.73,460.04 mg。樣品流速越慢,泄漏點(diǎn)出現(xiàn)的越晚,吸附量也較大,但上樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng),工作效率降低。綜合考慮,上樣流速為1.0~2.0 mL/min時(shí)較為適宜。

    2.3.2 乙醇洗脫流速對(duì)解吸的影響 由圖6可知,隨著洗脫液的流出,多酚逐漸被洗脫出來(lái),乙醇溶液在不同流速下對(duì)多酚的洗脫效果均較好。流速越快,多酚越早被洗出,但洗脫峰有拖尾現(xiàn)象,流速慢,洗脫曲線(xiàn)峰較為集中,多酚溶液濃度較高,洗脫液收集區(qū)間為100~200 mL。因此,洗脫流速為1 mL/min較為適宜。

    2.4 乙醇梯度洗脫和高效液相色譜分析

    如圖7所示,蒸餾水洗脫未檢測(cè)到酚類(lèi)物質(zhì),而在10%,20%,30%和40%濃度下得到了4個(gè)洗脫組分,分別為DHP-1,DHP-2,DHP-3和DHP-4。通過(guò)高效液相色譜分析(圖8),4個(gè)洗脫組分的含量分別為16.3%,14.8%,20.9%,26.2%,經(jīng)樹(shù)脂處理后4個(gè)組分的總多酚純度為76.2%。

    圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AB-8樹(shù)脂解吸多酚的影響

    圖5 上樣流速對(duì)AB-8樹(shù)脂吸附能力的影響

    圖6 乙醇流速對(duì)動(dòng)態(tài)解吸AB-8樹(shù)脂中霍山石斛多酚的影響

    圖7 AB-8樹(shù)脂的乙醇梯度洗脫圖譜

    圖8 粗多酚和梯度洗脫組分的高效液相色譜圖譜

    2.5 霍山石斛多酚的體外抗氧化能力

    2.5.1 超氧陰離子的清除 超氧陰離子過(guò)多會(huì)對(duì)機(jī)體的DNA和蛋白質(zhì)等造成損傷[19],有效清除機(jī)體中過(guò)多超氧陰離子等活性氧是開(kāi)發(fā)功能性食品的關(guān)鍵。如圖9所示,隨著樣品濃度的增加,多酚各個(gè)組分對(duì)超氧陰離子的清除能力也越強(qiáng),當(dāng)濃度達(dá)到0.4 mg/L時(shí),各個(gè)多酚組分之間的清除能力差異較為明顯,且趨于穩(wěn)定,其中DHP-1組分與同濃度的維生素C相比,差異性不顯著(P>0.05),說(shuō)明霍山石斛多酚組分具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子的能力,且其清除能力依次為DHP-3>DHP-4>DHP-1>DHP-2>粗多酚。DHP-3對(duì)超氧陰離子能力接近維生素C,可以作為很好的抗氧化劑,開(kāi)發(fā)功能性食品。

    2.5.2 霍山石斛多酚總還原力的比較 如圖10所示,在整個(gè)還原力指標(biāo)中,4個(gè)多酚分離組分之間的還原力差異較為明顯,且其還原力大小依次為DHP-3>DHP-4>DHP-1>DHP-2>粗多酚。相比于維生素C,還原力的差異性較為顯著。

    圖9 多酚組分對(duì)超氧陰離子的清除率

    3 結(jié)論

    通過(guò)靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)篩選出了適于霍山石斛多酚分離純化的樹(shù)脂AB-8,其最佳分離純化工藝條件為:靜態(tài)吸附150 min 即達(dá)到飽和,多酚溶液pH 4.0,濃度2.0 mg/mL,上樣流速1.0 mL/min;洗脫流速1.0 mL/min。通過(guò)10%,20%,30%,40%的乙醇溶液的梯度洗脫,獲得了4個(gè)洗脫組分,分別為DHP-1、DHP-2、DHP-3、DHP-4,其含量分別為16.3%,14.8%,20.9%,26.2%,總酚的純度達(dá)到76.2%;霍山石斛多酚的抗氧化能力較為顯著,各組分抗氧化活性由大到小依次為DHP-3>DHP-4>DHP-1>DHP-2>粗多酚,且隨著樣品濃度的增加,總的還原力和對(duì)超氧陰離子清除能力逐漸增加,呈明顯的濃度相關(guān)性。但4個(gè)洗脫組分的多酚具體成分組成還有待進(jìn)一步研究。

    圖10 多酚總還原力的比較

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