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    丁香酚對水產(chǎn)品中普羅威登斯菌的抑制作用

    2020-12-07 08:41:54圖爾蓀阿依圖爾貢付龍龍努爾古麗熱合曼劉小莉
    食品與機(jī)械 2020年11期
    關(guān)鍵詞:威登丁香酚肉湯

    圖爾蓀阿依·圖爾貢 王 帆 付龍龍努爾古麗·熱合曼 劉小莉

    (1. 新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830054;2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇 南京 210014;3. 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所,江蘇 南京 210017)

    普羅威登斯菌(Providenciavermicola)是一類能夠?qū)е率称犯瘮∽冑|(zhì)的革蘭氏陰性腐敗菌,屬于腸道桿菌科,為條件致病菌,廣泛存在于土壤、水體、食品中,不僅影響食品質(zhì)量安全,還會引起人體腹瀉、腸道內(nèi)微感染、尿道感染等[1-2]。何鵬暉等[3]發(fā)現(xiàn)普羅威登斯菌在腐敗發(fā)酵蔬菜中具有產(chǎn)醭特性。施荷等[4]研究表明,冷卻鹿肉貯藏初期會產(chǎn)生普羅威登斯菌,且在貯藏中期活力逐漸增強(qiáng),是冷卻鹿肉貯藏末期的優(yōu)勢菌屬。黃佳奇[5]研究表明,不同包裝條件下小黃魚表面優(yōu)勢腐敗菌差異較大,普羅威登斯菌是空氣包裝小黃魚的優(yōu)勢腐敗菌之一。課題組[6]從自然腐敗的香辣蟹樣品中分離鑒定出一株普羅威登斯菌,且食品工業(yè)中常用的化學(xué)防腐劑如苯甲酸鈉、山梨酸鉀等,以及生物保鮮劑乳酸鏈球菌素(Nisin)對該菌沒有抑制作用。

    丁香酚(Eugenol)是一種熱穩(wěn)定性好、毒性較低、不易殘留的天然香料。作為丁香精油的主要成分,丁香酚對導(dǎo)致食品腐敗的多種細(xì)菌和真菌具有較強(qiáng)抑制作用[7-8],如金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、福氏痢疾桿菌、鼠傷寒沙門菌、大腸埃希菌、李斯特菌、沙克乳酸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌以及根霉菌、鏈格孢菌、灰霉菌等,因而常被用于食品的防腐保鮮[9-11]。試驗擬以前期從香辣蟹樣品優(yōu)勢腐敗菌中分離的普羅威登斯菌作為指示菌,研究并探討丁香酚對普羅威登斯菌的抑制效果及抑菌機(jī)理,為后續(xù)丁香酚應(yīng)用于水產(chǎn)保鮮提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    普羅威登斯菌:從自然腐敗的香辣蟹樣品中分離鑒定,菌株編號XLX5,16S rDNA序列結(jié)果提交至GenBank核酸數(shù)據(jù)庫得到Accession number為KC456588,保藏于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室;

    丁香精油:丁香酚含量85%,批號2017030102,用乙醇溶解并配成有效濃度為1 mg/mL母液,江西金源天然香料有限公司;

    乳酸鏈球菌素(Nisin)、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、殼聚糖、蘋果酸脫氫酶(MDH)酶活測定試劑盒、琥珀酸脫氫酶(SDH)酶活測定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白濃度測定試劑盒:南京建成生物試劑有限公司;

    BCA蛋白濃度測定試劑盒:南京天為生物科技有限公司;

    營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:北京奧博星生物有限責(zé)任公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    酶標(biāo)儀:Epoch型,美國Bioteck公司;

    掃描電子顯微鏡:MERLIN型,德國ZEISS公司;

    日立透射電鏡:HT7700型,日本Hitachi公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 普羅威登斯菌懸浮液的制備 將P.vermicola接種于無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃,150 r/min下活化培養(yǎng)24 h,用新鮮無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基調(diào)整菌懸液細(xì)菌濃度為1×107CFU/mL,備用。

    1.3.2 體外抑菌試驗 采用平板孔阱擴(kuò)散法初步測定抗菌活性。按1%接種量將活化好的P.vermicola菌懸液接種至無菌營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基中,倒平板。待培養(yǎng)基冷凝后,用直徑為7 mm的打孔器于平板上均勻打出3個孔,分別吸取50 μL 1 mg/mL丁香酚、Nisin、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、殼聚糖注入孔中,37 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈大小,重復(fù)3次取平均值[12]。

    1.3.3 丁香酚最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測定 根據(jù)文獻(xiàn)[13]確定丁香酚最小抑菌濃度(MIC)。將丁香酚用無菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基稀釋至終濃度分別為1.000,0.500,0.250,0.125,0.063,0.031 mg/mL,備用。向96孔板中分別加入100 μL不同濃度的丁香酚稀釋液,再加入100 μL菌濃度為1×107CFU/mL的P.vermicola菌懸液。分別設(shè)置陰性對照(100 μL菌懸浮液+100 μL營養(yǎng)肉湯)和空白對照(200 μL營養(yǎng)肉湯),37 ℃ 培養(yǎng)24 h。以陰性對照中P.vermicola生長呈渾濁和空白對照透明為前提,其他孔內(nèi)培養(yǎng)物渾濁情況判斷最小抑菌濃度。從96孔板中取樣液渾濁度明顯減少的丁香酚溶液,涂布接種至無菌的固體營養(yǎng)肉湯平板中,37 ℃培養(yǎng)24 h,未見菌落生長的為最低殺菌濃度(MBC),重復(fù)3次。

    1.3.4 丁香酚對菌體的處理 取96微孔板,每孔加入100 μL菌濃度為1×107CFU/mL的菌懸液及100 μL丁香酚溶液,丁香酚溶液終濃度分別為1 MIC、2 MIC。分別設(shè)置陰性對照(100 μL菌懸浮液+100 μL營養(yǎng)肉湯)和空白對照(200 μL營養(yǎng)肉湯),于37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

    1.3.5 丁香酚對菌體生長曲線的影響 取96微孔板,每孔加入100 μL菌濃度為1×107CFU/mL的菌懸液及100 μL丁香酚,丁香酚終濃度分別為1 MIC、2 MIC。分別設(shè)置陰性對照(100 μL菌懸液+100 μL營養(yǎng)肉湯)和空白對照(200 μL營養(yǎng)肉湯),置于37 ℃培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)。每2 h用酶標(biāo)儀測定620 nm處OD值,重復(fù)3次取平均值。

    1.3.6 丁香酚對普羅威登斯菌形態(tài)的影響

    (1) 樣品前處理:將1.3.4中培養(yǎng)物于4 ℃、10 000 r/min離心10 min,收集菌體。以磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol/L,pH 7.0)洗滌菌體3次。所得菌體置于4 ℃、2.5%戊二醛中過夜固定。固定好的細(xì)菌用pH 7.0磷酸緩沖液漂洗3次,每次靜置10 min,除去戊二醛。

    (2) 掃描電鏡觀察:將1.3.6(1)樣品依次置于30%,50%,70%,80%,90%,100%的乙醇中脫水置換,每次15 min。脫水后臨界點干燥,將干燥的菌體固定至金屬臺上,用離子濺射儀對噴金、鍍膜,采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

    (3) 透射電鏡觀察:將1.3.6(1)樣品置于1%四氧化鋨中固定3 h;除去固定劑的樣品分別經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為50%,70%,80%,90%,100%的乙醇脫水,每次15 min,繼續(xù)用100%丙酮溶液脫水3次,用Epon812固定劑進(jìn)行包埋,超薄切片,經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后,采用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察和圖像采集。

    1.3.7 丁香酚對普羅威登斯菌內(nèi)容物泄露的影響 取96微孔板,每孔加入100 μL菌濃度為1×107CFU/mL的菌懸液及100 μL丁香酚溶液,丁香酚溶液終濃度分別為0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC。分別設(shè)置陰性對照(100 μL菌懸浮液+100 μL營養(yǎng)肉湯)和空白對照(200 μL營養(yǎng)肉湯),于37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將丁香酚處理組和空白對照組培養(yǎng)物于4 ℃、4 000 r/min離心10 min。取上清分別測定260,280 nm處OD值。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上清液中可溶性蛋白含量。

    1.3.8 菌體內(nèi)蘋果酸脫氫酶(MDH)酶活和琥珀酸脫氫酶(SDH)酶活變化 將收集的對數(shù)期P.vermicola用0.75% 生理鹽水洗滌重懸為1×107CFU/mL的菌懸浮液,添加丁香酚使其終濃度為1 MIC,未添加丁香酚作為空白對照,于37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取菌懸液10 000 r/min低溫離心10 min,收集菌體,并用0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液洗滌3次,每組試驗平行3次。加入與菌體等體積的2 mg/mL的溶菌酶溶液,攪拌均勻,37 ℃水浴15 min后,迅速冰浴,加入等體積的0.1 mol/L SDS Tris-HCl(pH 9.0)緩沖液,10 000 r/min低溫離心15 min,取上清液備用。按試劑盒說明書方法進(jìn)行MDH、SDH酶活檢測。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    采用SPSS軟件整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(P<0.05),采用OriginPro 8.5軟件繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 體外抑菌試驗

    抑菌試驗結(jié)果顯示,丁香酚處理組透明抑菌圈可達(dá)(21.6±0.3) mm,抑菌作用顯著。殼聚糖處理組可延緩P.vermicola生長,但不能完全抑制,表現(xiàn)為平板上出現(xiàn)模糊的抑菌圈;Nisin、山梨酸鉀、苯甲酸鈉處理組均沒有出現(xiàn)透明抑菌圈,說明三者對P.vermicola沒有抑菌活性。當(dāng)丁香酚濃度>0.25 mg/mL時,P.vermicola處理組孔內(nèi)培養(yǎng)物比陰性對照組清澈,由此確定最低抑菌濃度為0.25 mg/mL;當(dāng)丁香酚濃度為0.5 mg/mL時,平板上沒有菌落生長,故最低殺菌濃度為0.5 mg/mL。

    2.2 生長曲線

    由圖1可知,對照組的OD值在8 h內(nèi)顯著升高,進(jìn)入對數(shù)生長期(P<0.05)。與對照組(CK)相比,0.5,1.0 MIC 丁香酚處理組分別于20,18 h后進(jìn)入對數(shù)生長期且菌體生長速度明顯延遲于對照組,而2.0 MIC組的OD值幾乎沒有增加。這表明丁香酚可以抑制P.vermicola的生長并延遲細(xì)菌對數(shù)期的生長時間。

    圖1 丁香酚對普羅威登斯菌生長曲線影響

    2.3 丁香酚對普羅威登斯菌形態(tài)的影響

    2.3.1 掃描電鏡 由圖2可知,與對照組相比,丁香酚處理P.vermicola菌體表面發(fā)現(xiàn)皺紋、菌體不飽滿、缺乏充盈感,少量細(xì)胞出現(xiàn)損壞,菌體表面粗糙、不光滑,菌體周邊呈現(xiàn)明顯的內(nèi)容物泄漏。

    2.3.2 透射電鏡圖 由圖3可知,未經(jīng)丁香酚處理的P.vermicola細(xì)胞飽滿,有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu),細(xì)胞大小均一且形狀規(guī)則,細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和核區(qū)層次分明且清晰可見,細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)容物分布均勻且充實致密,細(xì)胞核緊實并且均勻分布于細(xì)胞中間。而經(jīng)丁香酚處理后,菌體細(xì)胞開始出現(xiàn)皺褶,細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)不集中,細(xì)胞壁分解不明顯,細(xì)胞壁和細(xì)胞膜變薄,邊界不清晰,質(zhì)壁之間出現(xiàn)小的間斷,有小的空白區(qū),細(xì)胞質(zhì)含量減少并且分布不均,核區(qū)分布逐漸分散,聚攏并且邊聚,出現(xiàn)小的空洞。

    2.4 內(nèi)容物泄漏

    細(xì)胞壁和細(xì)胞膜具有保護(hù)細(xì)菌的作用,是細(xì)菌正常生長的基本保障。細(xì)菌壁膜系統(tǒng)一旦遭到破壞,會造成分布于細(xì)菌內(nèi)部的許多重要生物大分子如:核酸、蛋白質(zhì)、糖類等的外流,影響細(xì)菌合成代謝功能。通過測定滲漏至細(xì)胞外相關(guān)生物大分子含量變化,可以反映細(xì)菌壁膜系統(tǒng)的完整性[14]。嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)中均含有共軛雙鍵,核酸在260 nm處對紫外線有最大吸收值;氨基酸中含有共軛雙鍵的色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在紫外線280 nm處,因此OD260 nm、OD280 nm值可反映菌體內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)物質(zhì)泄漏情況。

    由圖4可知,與對照組相比,經(jīng)不同濃度丁香酚處理18 h后,普羅威登斯菌培養(yǎng)物上清液OD260 nm、OD280 nm值以及可溶性蛋白含量均不同程度增加,2.0 MIC 丁香酚處理后OD值以及蛋白含量顯著增加(P<0.05),說明丁香酚能夠作用于P.vermicola的壁膜系統(tǒng),導(dǎo)致細(xì)菌壁膜系統(tǒng)遭到損傷,造成細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)外流。

    圖2 普羅威登斯菌掃描電鏡圖

    圖3 普羅威登斯菌透射電鏡圖

    小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

    2.5 蘋果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)酶活變化

    由表1可知,與對照組相比,P.vermicola丁香酚處理組MDH和SDH酶活均顯著下降,其作用機(jī)理可能是丁香酚影響MDH和SDH的分子結(jié)構(gòu),使其發(fā)生變化,改變構(gòu)像,降低酶活性[15]。由此可推斷,丁香酚通過降低MDH和SDH酶活力,破壞細(xì)胞的能量代謝途徑,抑制P.vermicola生長。

    表1 丁香酚對普羅威登斯菌MDH和SDH酶活的影響?

    3 結(jié)論

    以一株分離自水產(chǎn)品中的普羅威登斯菌為研究對象,研究丁香酚對其的抑菌效果。結(jié)果表明,丁香酚對普羅威登斯菌有一定的抑制作用,且抑制效果具有劑量依賴性,最低抑制濃度為0.25 mg/mL。丁香酚促使普羅威登斯菌菌體嚴(yán)重變形,破壞菌體的完整性,使胞內(nèi)物質(zhì)泄漏,胞外可溶性蛋白含量提高,引起細(xì)胞內(nèi)部滲透壓不穩(wěn)定,進(jìn)而影響細(xì)菌胞內(nèi)生理生化反應(yīng),以及胞內(nèi)維持細(xì)胞正常生長代謝相關(guān)的酶類,如蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶酶活的降低,從而表現(xiàn)出抑菌特性。丁香酚對水產(chǎn)品中普羅威登斯菌抑菌效果顯著,其抑菌機(jī)理與影響細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的通透性和完整性,干擾細(xì)菌生理代謝活動有關(guān)。后期可開展丁香酚在香辣蟹產(chǎn)品中應(yīng)用相關(guān)研究。

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