楊樹爛皮病菌的致病性及豚草抑菌研究

矯麗曼， 梁泰銘， 紀純陽， 李曉宇， 張 妍

(1.遼寧省楊樹研究所, 遼寧 蓋州 115213； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學林學院, 遼寧 沈陽 110161)

楊樹爛皮病又稱腐爛病，病原有性階段為污黑腐皮殼ValsasordidaNit.，無性階段為金黃殼囊孢菌Cytosporachrysosperma(Pers.) Fr.[1-2]。爛皮病是楊樹的重要枝干病害，是潛伏侵染性病害，當出現(xiàn)水澇、干旱、凍害、日灼等惡劣條件，以及苗木移植或強度修剪后不易恢復樹木生機時，病害便迅速發(fā)生，輕者影響樹木生長，出現(xiàn)放葉晚、葉片變小、枯枝、枯干等病狀，重者造成樹木成片死亡[2-5]。

豚草AmbrosiaartemisiifoliaL.，屬菊科Compositae豚草屬Ambrosia，又名艾葉破布草、美洲艾，一年生草本植物，原產(chǎn)于美國，20世紀30年代初傳入我國東部沿海，現(xiàn)在全國范圍內(nèi)廣泛分布[6-7]。豚草生長于荒地、路邊、水溝旁、田塊周圍或農(nóng)田中，具有生命力強、生長旺盛、適應性廣、種子產(chǎn)量高、耗水量大和營養(yǎng)物質高等特點，遮蓋和壓抑周圍的作物，阻礙農(nóng)業(yè)操作，導致作物減產(chǎn)甚至絕收[8]。同時豚草花粉極易引起過敏反應[7]。許多學者對豚草進行了各方面的研究，豚草粗提物具有殺蟲、抑菌和滅螺等多種生物活性[9-10]。

楊樹爛皮病傳統(tǒng)的防治方法是將樹木病灶處用刀劃開后涂堿水，效果往往不明顯。用廣譜的抑菌藥劑雖達到較好抑菌效果，但對生態(tài)環(huán)境造成污染。本文研究了小葉楊爛皮病的致病性，并進行豚草粗提物對爛皮病及致病病斑抑菌試驗，這一研究為植物源農(nóng)藥在林業(yè)病蟲害防治中的應用提供一定的理論基礎[11]。

1 試驗材料

1.1 植物材料

小葉楊枝條采自內(nèi)蒙古庫倫旗地區(qū)，修剪后放于溫室內(nèi)水培。

豚草采自遼寧省蓋州市高麗城和西海等地區(qū)。將采集的豚草葉片用清水洗凈，放于通風陰涼處陰干，再用50 ℃烘箱烘干至恒重后，用中藥材粉碎機粉碎，稱重分裝于棕色試劑瓶中，放于陰涼處保存?zhèn)溆肹12-13]。

1.2 試驗菌株

楊樹爛皮病菌株，購自中國林業(yè)科學研究院林業(yè)菌種保存中心，編號為88513。

2 試驗方法

2.1 小葉楊爛皮病的致病性試驗

采取燙傷和不燙傷兩種接種處理方法。接種前用75%的酒精消毒樹皮表面，不燙傷接種方法是用無菌手術刀在消毒的樹皮表面切去一小塊韌皮部，用接種針挑取適量菌絲放于切口處，再把切取的樹皮覆蓋在切口上；燙傷接種方法是用已燒熱的打孔器(直徑5 mm)刺入枝干，然后用手術刀在燙傷處切一圓形傷口(不傷害枝條的木質部)，再將預先用打孔器(直徑5 mm)打好的菌柄接種于傷口處，最后將2種接種處理方法中的切口處均用浸泡無菌水的脫脂棉包好，用保鮮膜包扎保濕。為了后期的抑菌試驗燙傷接種150個，未燙傷接種60個。每3 d換一次水，每天打兩次氧，保證枝條正常生長。接種3 d后拆開保鮮膜，開始觀察“病斑”的發(fā)生發(fā)展情況，以“病斑”橫向大小為主要標準，記錄是否發(fā)病和發(fā)病癥狀[14-16]。

2.2 豚草粗提物對楊樹爛皮病的抑菌試驗

2.2.1 含豚草粗提物培養(yǎng)基的制備 楊樹爛皮病病原菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用溫浸-超聲波聯(lián)合提取法提取豚草粗提物。將滅好菌的培養(yǎng)基趁熱放于無菌的超凈工作臺中，當培養(yǎng)基的溫度降至40 ℃左右時，將預先配置好的豚草粗提物溶液分別加入PDA培養(yǎng)基中，以加水為對照，使豚草粗提物在培養(yǎng)基中最終濃度分別為0、0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0 mg·mL-1，混合均勻后倒入平皿，待培養(yǎng)基冷卻后即得到含不同濃度豚草粗提物的PDA培養(yǎng)基，每個濃度重復6次[17-18]。

2.2.2 抑菌試驗 在無菌條件下，用直徑5 mm的無菌打孔器在預先培養(yǎng)好的楊樹爛皮病病原菌菌株平面上打成圓形菌柄，用無菌鑷子夾取菌柄放于含豚草粗提物的培養(yǎng)基中，每皿接種一塊，用封口膜封好，放于25 ℃的生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[19-20]。

2.2.3 統(tǒng)計方法 采用生長速率法測定菌絲的生長抑制率，并用DPS 18.10高級版LDS法進行數(shù)據(jù)分析[21-22]。定期觀察菌絲的生長情況，待對照菌絲延伸至平皿邊緣時停止生長，用十字交叉法測量菌落直徑，取2次的平均值計算抑菌率[23-24]，詳見式(1)和式(2)。

生長直徑=測量菌絲直徑的平均值-菌柄的直徑

(1)

(2)

2.3 致病病斑的抑菌試驗

根據(jù)試驗結果和致病病斑的數(shù)量，將豚草粗提物配置成20.0、40.0、80.0 mg·mL-1濃度的溶液，以不處理的病斑為對照。對已發(fā)病的小葉楊爛皮病病斑用無菌刀片順枝條方向刮破樹皮，用小毛刷進行涂抹各濃度的豚草粗提物溶液，并在病斑邊緣用圓珠筆做好標記，隔24 h再涂抹一次豚草粗提物溶液，觀察病斑的變化，統(tǒng)計抑菌效果，計算出平均抑菌率，確定適宜的抑菌濃度[25]，詳見式(3)。

平均抑菌率=(抑菌病斑數(shù)/處理病斑數(shù))×100%

(3)

3 結果與分析

3.1 致病性試驗結果

燙傷與未燙傷2種接種處理結果見表1，由表1可知，未燙傷處理的枝條均未發(fā)病，而燙傷處理的枝條發(fā)病率為92.00%，燙傷接種后5 d菌柄周圍的樹皮開始變成黃色，慢慢向周圍擴展，接種15 d后病斑平均直徑已達到19.13 mm。圖1為3株小葉楊枝條燙傷接種楊樹爛皮病病原菌的發(fā)病情況。

表1 小葉楊爛皮病的致病性試驗結果Tab.1 Pathogenicity test results of Cytospora chrysosperma(Pers.) Fr. in P. simonii Carr.處理接種病斑數(shù)侵染病斑數(shù)發(fā)病率/%病斑平均直徑/mm燙傷15013892.0019.13未燙傷6000.000.00

3.2 楊樹爛皮病室內(nèi)抑菌試驗結果

爛皮病病原菌菌絲在含豚草粗提取的PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，培養(yǎng)10 d對照組菌絲長至平皿邊緣，此時各濃度的抑菌率見表2。由表2可知，豚草粗提物濃度為1.0 mg·mL-1時，平均抑菌率為68.32%；濃度為16.0 mg·mL-1時，抑菌率達到82.34%，且各處理間菌絲生長直徑和抑菌率在0.05水平上存在顯著性差異。

圖2為豚草粗提物7個不同濃度處理對楊樹爛皮病病原菌的抑菌效果比較，圖3為16.0 mg·mL-1豚草粗提物對爛皮病的抑菌效果。由圖2和圖3可知，對照菌絲向外延伸至平皿邊緣，產(chǎn)生孢子，菌落為棕色，而豚草粗提物抑制后的菌絲向外延伸很小，菌落為白色，未產(chǎn)孢子。通過試驗得到不同濃度的豚草粗提物對楊樹爛皮病有較好的抑菌作用，并隨濃度的增加而增大，豚草粗提物對楊樹爛皮病病原菌有較高的抑菌效果。

表2 不同濃度豚草粗提物對楊樹爛皮病病原菌的抑菌率Tab.2 Bacteriostatic rate of Ambrosia artemisiifolia L.crude ex-tracts with different concentrations to the pathogen of Cy-tospora chrysosperma(Pers.) Fr.粗提物濃度/(mg·mL-1)處理10 d時菌落生長直徑/mm抑菌率/%CK78.24 a0.00 f0.557.17 b26.68 e1.024.80 c68.32 d4.023.32 cd70.24 cd8.020.19 cd74.19 bc12.018.86 de75.93 b16.013.85 f82.34 a 注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同處理存在顯著差異 (P﹤0.05)。下同。

3.3 致病病斑的抑菌試驗結果

通過試驗可知：3種濃度豚草粗提物對小葉楊爛皮病病斑的抑制效果均達到85%以上，40.0 mg·mL-1粗提物的平均抑菌率為91.89%，80.0 mg·mL-1粗提物平均抑菌率為92.11%，這說明從40.0 mg·mL-1粗提物開始，隨著豚草粗提物濃度的增加其抑菌效果而緩慢增大，抑制后病斑直徑與對照直徑在0.05水平上存在顯著性差異。從藥劑使用量和抑菌效果綜合考慮，豚草粗提物對小葉楊爛皮病病斑的最適宜抑制濃度為40.0 mg·mL-1。抑制效果見圖4，抑制的病斑向外幾乎無擴大。

表3 豚草粗提物對楊樹爛皮病病斑的抑菌效果統(tǒng)計Tab.3 The bacteriostatic effect statistics of Ambrosia artemisiifolia L. extracts to Cytospora chrysosperma(Pers.) Fr.粗提物濃度/(mg·mL-1)處理病斑數(shù)/個抑制病斑數(shù)/個抑菌前病斑平均直徑/mm抑菌后病斑平均直徑/mm平均抑菌率/%CK25020.15 a23.47 a020.0373219.96 ab20.41 bc86.4940.0373419.63 ab19.66 c91.8980.0383519.56 b19.58 c92.11

4 結論與討論

通過研究，得到了爛皮病對燙傷接種處理的小葉楊枝條有較高的致病性，豚草粗提物對楊樹爛皮病及致病病斑具有較好的抑菌效果，并隨其濃度的增加抑菌率而增大。

試驗材料小葉楊，屬于青楊派樹種，樹皮光滑易染病，便于觀察。致病性試驗選用了燙傷和未燙傷兩種接種處理方法，燙傷接種處理的枝條發(fā)病率為92.00%，而未燙傷接種處理的枝條均未發(fā)病?？梢娫谑覂?nèi)枝條致病性試驗中燙傷接種處理是爛皮病侵染的必要條件，燙傷可使傷口周圍達到無菌的環(huán)境，浸水脫脂棉保持菌絲生長的濕度，周圍環(huán)境保證菌絲生長的溫度，這些都有利于接種病原菌在枝條上侵染生長。崔永亮等[26]以病斑愈合率為指標。本試驗枝條屬于離體水培，培養(yǎng)到一定時間，因營養(yǎng)條件不足枝條枯萎，致病病斑經(jīng)豚草粗提物處理后未達到愈合的程度，所以本試驗以平均抑菌率為主要指標確定抑菌效果。在原有試驗基礎上，還需研究楊樹爛皮病對其他派楊樹品種的致病性，得出侵染規(guī)律，利于后期開展野外林地的抑菌試驗。同時還需開展豚草粗提物與廣譜殺菌劑抑菌效果比較。

前人已經(jīng)開展了豚草粗提物對楊樹爛皮病的室內(nèi)抑菌試驗，筆者在前人研究基礎上開展了小葉楊離體枝條爛皮病的致病性和豚草粗提物對小葉楊爛皮病致病病斑的抑菌作用研究，以期為豚草粗提物用于林業(yè)病害的野外防治及果樹、一些觀賞樹木病害防治提供前期的試驗基礎，為確定用于生產(chǎn)和防治工作的新型植物源農(nóng)藥提供前期研究基礎，對推進無公害農(nóng)藥的研究和應用有著重大的意義。