化痰活血降氣方對慢性阻塞性肺疾病大鼠臟器指數(shù)及血清TNF-α、IL-1β、ET-1水平的影響?

余 寧 周新燕 張 念 余 丹 楊 碩 葉樹鳴

（湖北省武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢 430022）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種因長期吸入有害氣體或顆粒導(dǎo)致進展性的氣流受限不完全可逆的呼吸系統(tǒng)疾病[1]。本實驗團隊前期臨床研究表明，化痰活血降氣方能顯著降低COPD患者多種炎癥因子水平和C反應(yīng)蛋白（CRP）的水平，減輕炎癥反應(yīng)，從而減少氣道重塑和氣道阻塞，緩解COPD喘氣、胸悶、呼吸困難等急性癥狀[2-3]。本實驗通過化痰活血降氣方對COPD大鼠模型進行干預(yù)，對大鼠肺組織進行病理形態(tài)學(xué)觀察，檢測肺臟、脾臟、胸腺等臟器指數(shù)和血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、內(nèi)皮素-1（ET-1）水平，進一步探討化痰活血降氣方在COPD治療中的抗炎機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級wistar大鼠36只，來源于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（京）2016-0002]。大鼠體質(zhì)量200～220 g，實驗動物合格證號：NO.11401500057734。在室內(nèi)采光、通風(fēng)良好，溫度20～25℃，相對濕度30%～50%的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。

1.2 實驗藥物

醋酸潑尼松片（華中藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號20180505，每片5mg）。化痰活血降氣方顆粒劑（四川綠色藥業(yè)生產(chǎn)），組成：赤芍（批號18040038）10 g，桃仁（批號18060087）10 g，紫蘇子（批號18080061）10 g，款冬花（批號18020095）10 g，丹參（批號 18080028）30 g，瓜蔞皮（批號18050010）10 g，浙貝母（批號18040054）10 g，麻黃（批號17050111）10 g，黃芩（批號18030117）10 g，魚腥草（批號17100130）30 g，杏仁（批號 18060087）10 g，苦參（批號18020100）10 g。

1.3 儀器與試劑

1）儀器：FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），JT-12J電腦生物組織脫水機（武漢俊杰），JK-6生物組織攤烤片機SCXK（京）2016-0002），德國Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式病理切片機（德國Leica公司），奧林巴斯BX53型生物顯微鏡（日本奧林巴斯）。2）試劑：大鼠TNF-α、IL-1β、ET-1酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；無水乙醇（10009218，國藥集團），二甲苯（10023418，國藥集團），鹽酸（10011018，國藥集團），包埋石蠟（69019361，國藥集團），中性樹膠（10004160，國藥集團），蘇木素（Sigma，H9627）。

1.4 分組及模型制備

1）分組：將36只大鼠隨機分為6組：為空白組、陽性對照組、模型組和化痰活血降氣方大、中、小劑量組，每組6只。2）模型制備：采用氣管內(nèi)滴注LPS加煙熏法復(fù)制COPD模型。分別在第1、14天氣管內(nèi)滴注LPS（0.1 mg/100 g），第2至第13日，第15至28日時在容積為48 L的玻璃密閉箱內(nèi)持續(xù)熏黃鶴樓牌香煙霧30 min，每日1支，每日1次。造模28 d結(jié)束后統(tǒng)一藥物干預(yù)。

1.5 干預(yù)方法

造模結(jié)束后，化痰活血降氣方組和陽性對照組分別進行中藥顆粒及陽性藥物灌胃治療，持續(xù)28 d。臨床用藥量為160 g/d，換算成動物灌胃劑量為160×0.018×5=14.4 g/（kg·d）。中劑量組按照14.4g/（kg·d）灌胃，大劑量組為中劑量組×2，即28.8 g/（kg·d），低劑量組為中劑量組/2，即7.2 g/（kg·d）。陽性對照藥物用醋酸潑尼松片灌胃28 d，每天1次，臨床劑量為50 mg/d，灌胃劑量為50×0.018×5=4.5 mg/（kg·d）?；祷钛禋夥浇M在造模結(jié)束后分別予相應(yīng)用藥劑量中藥溶液5mL/d灌胃，陽性對照組予潑尼松混懸液5 mL/d灌胃，模型組予生理鹽水5 mL/d灌胃。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 蘇木青-伊紅（HE）染色觀察對大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)變化 對大鼠左肺取肺組織脫水，經(jīng)透明，浸蠟，包埋，切片烤片，脫蠟，經(jīng)Mayer氏蘇木素染液染色5～7 min后浸洗返藍，1%的鹽酸酒精分化2～5 s后浸洗返藍，1%的伊紅染液染1 min水洗，風(fēng)干后中性樹膠封片，最后鏡檢。取100和200倍各3張。

1.6.2 檢測各組大鼠肺臟、脾臟和胸腺指數(shù) 摘取肺臟、脾臟和胸腺后，用濾紙吸干殘血后，稱質(zhì)量（mg），分別除以大鼠體質(zhì)量（g），再乘以10，得到肺臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。肺臟指數(shù)=肺臟質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）×10，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）×10，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）×10。

1.6.3 ELISA檢測大鼠血清中TNF-α、IL-1β、ET-1水平 收集大鼠血液，在3 000 r/min離心10 min，吸取上部清亮的血清加樣，37℃孵育90 min。棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，立即每個孔中加入生物素化抗體100 μL，37℃孵育1 h，洗板5次，每孔加酶結(jié)合物抗體工作液100 μL，37℃溫育30 min。棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，每孔加底物100 μL，37℃避光孵育15 min。每孔加100 μL終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD值），計算各樣本中相關(guān)指標(biāo)濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示。選用正態(tài)性檢驗及方差分析，若服從正態(tài)分布及方差齊性檢驗，采用單因素方差分析及事后檢驗多重比較（LSD），方差不齊采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)結(jié)果

見圖1?？瞻捉M肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁未見明顯異常。模型組大量炎癥細胞浸潤，肺泡壁變薄，肺泡間隔斷裂融合，肺泡腔變大。陽性對照組炎癥細胞顯著減少，肺泡壁明顯增厚，肺泡腔變小?；祷钛禋夥酱髣┝拷M炎癥細胞浸潤明顯好轉(zhuǎn)，肺泡壁明顯增厚，肺泡間隔斷裂融合較模型組改善，肺泡腔顯著變小。化痰活血降氣方中劑量組炎癥浸潤稍有好轉(zhuǎn)，肺泡壁稍有增厚，肺泡腔稍變小。化痰活血降氣方小劑量組肺部炎癥細胞浸潤，肺泡壁薄，肺泡腔融合現(xiàn)象與模型組較為接近。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)比較（HE染色，200倍）

2.2 各組臟器指數(shù)變化比較

見表1。1）肺臟指數(shù)：與空白組比較，模型組肺臟指數(shù)顯著增高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對照組和化痰活血降氣方大劑量組肺臟指數(shù)顯著降低（P＜0.01），中、小劑量組肺臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與陽性對照組比較，大劑量組肺臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。2）胸腺指數(shù)：與空白組比較，模型組胸腺指數(shù)稍有降低，但無明顯差異（P＞0.05）。與模型組比較，化痰活血降氣方各劑量組和陽性對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3）脾臟指數(shù)：與空白組比較，模型組脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組顯著增高（P＜0.05），化痰活血降氣方各劑量組均無明顯差異（P＞0.05）。

2.3 大鼠血清中TNF-α、IL-1β、ET-1水平比較

見表2。與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、ET-1水平顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和化痰活血降氣方各劑量均能顯著降低大鼠血清TNF-α、IL-1β、ET-1水平（P＜0.05或P＜0.01），其中大劑量組血清TNF-α、IL-1β水平低于中、小劑量組（P＜0.05或P＜0.01），大劑量組血清ET-1水平低于小劑量組（P＜0.01）。與陽性對照組比較，大劑量組血清TNF-α、ET-1水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組臟器指數(shù)比較（±s）

表1 各組臟器指數(shù)比較（±s）

與空白組比較，△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同

組別空白組模型組陽性對照組化痰活血降氣方大劑量組化痰活血降氣方中劑量組化痰活血降氣方小劑量組n 6 6 6 6 6 6肺臟指數(shù)42.35±3.09 52.97±3.45△45.21±3.13▲▲46.11±1.55▲▲50.39±2.23 51.47±2.37胸腺指數(shù)13.39±2.06 9.60±0.93 12.25±2.27 10.89±1.65 9.12±3.14 9.64±2.38脾臟指數(shù)21.11±2.06 15.36±2.43△19.97±3.52▲▲17.93±0.71 16.63±1.25 16.68±0.96

表2 各組血清細胞因子水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組血清細胞因子水平比較（pg/mL，±s）

與陽性對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01，與化痰活血降氣方大劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組陽性對照組化痰活血降氣方大劑量組化痰活血降氣方中劑量組化痰活血降氣方小劑量組n 6 6 6 6 6 6 TNF-α 79.94±2.73 255.7±16.70△118.39±7.84▲▲121.05±5.41▲▲169.59±8.37▲▲**##186.9±10.10▲▲**##IL-1β 36.97±2.29 124.1±6.34△58.19±4.36▲▲74.68±6.04▲▲*92.14±6.63▲▲**#102.2±5.72▲▲**##ET-1 35.48±2.28 75.53±3.01△45.16±3.74▲▲52.68±2.09▲▲60.72±2.32▲▲**65.98±4.85▲**##

3 討 論

COPD屬于中醫(yī)學(xué)“喘”“肺脹”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“痰”“瘀”是本病的主要病理因素，病機特點是本虛標(biāo)實。痰瘀為標(biāo)，肺脾腎氣虛為實[4]。外邪襲肺，肺失宣降，水液輸布失常，積聚成痰濕；痰濕困脾，脾氣虛致運化功能下降；脾濕內(nèi)蘊，日久郁而化熱，灼傷肺絡(luò)；痰濕內(nèi)蘊，阻滯氣機，氣不行則血瘀?；祷钛禋夥街械ⅰ⒊嗌中晕⒑?，清熱活血祛瘀加以桃仁活血化瘀，潤腸通便；黃芩善清上焦邪熱、配以苦參清熱燥濕；瓜蔞皮清熱化痰、寬胸散結(jié)；魚腥草配以浙貝母、黃芩清熱化痰、止咳平喘；麻黃宣肺平喘，紫蘇子、款冬花、杏仁降氣化痰平喘。全方共奏清熱化痰、活血化瘀平喘之效。

本研究通過氣管內(nèi)滴注LPS加煙熏法復(fù)制模型，觀察病理形態(tài)改變，COPD模型組大鼠肺組織有大量炎癥細胞浸潤，肺泡壁變薄，伴有肺泡斷裂融合肺泡腔變大，符合COPD的病理改變證明造模成功。與模型組比較，化痰活血降氣方大劑量組炎癥細胞的浸潤明顯好轉(zhuǎn)，肺泡間隔的斷裂融合改善，中劑量組肺組織炎性改變也有所減輕，并且大劑量組減輕炎癥反應(yīng)的作用與醋酸潑尼松相當(dāng)，佐證了化痰活血降氣方可以減輕氣道炎癥反應(yīng)和減輕肺組織重構(gòu)。

臟器指數(shù)在一定程度上可以衡量機體的變化，其中肺臟指數(shù)是反映機體肺部炎癥的指標(biāo)[5]，也反映大鼠肺的損傷程度[6]，胸腺、脾臟指數(shù)則反映機體免疫功能[5，7]。本實驗研究結(jié)果顯示，模型組肺臟指數(shù)較空白組顯著增高，提示COPD大鼠有肺部炎癥反應(yīng)和肺損傷，與模型組比較，陽性對照組及化痰活血降氣方大劑量組肺臟指數(shù)顯著降低，提示化痰活血降氣方大劑量可以顯著減輕肺組織的炎癥反應(yīng)，效果與醋酸潑尼松相當(dāng)。化痰活血降氣方各劑量組脾臟及胸腺指數(shù)與模型組無顯著差異，提示化痰活血降氣法對相關(guān)免疫功能均無顯著提高作用，與組成化痰活血降氣方的中藥藥物作用相一致。

COPD是呼吸系統(tǒng)常見的慢性炎癥性疾病，TNF-α是巨噬細胞及活性T細胞分泌的，既是急性炎癥的相關(guān)指標(biāo)，也是炎癥反應(yīng)的起始因子，通過促進炎癥細胞聚集活化和加速中性粒細胞外蛋白分解，參與炎癥反應(yīng)，加重了COPD氣道炎癥反應(yīng)和氣道重塑[8-10]。IL-1β炎癥因子由脂多糖內(nèi)毒素激活中性粒細胞釋放，從而引起肺組織水腫，加重氣道炎癥反應(yīng)[11-12]；COPD患者的肺血管內(nèi)皮細胞大量合成及釋放ET-1[13-14]，ET-1通過收縮肺血管引起缺血缺氧，使COPD患者出現(xiàn)喘息、呼吸困難等癥狀；同時還參與IL-6、IL-8炎癥因子的釋放，引起氣道炎癥反應(yīng)[15-16]。本實驗研究結(jié)果顯示模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、ET-1炎癥因子較空白組均顯著上升，提示COPD不僅會導(dǎo)致肺組織的炎癥反應(yīng)，也會使血清中炎癥因子水平顯著上升。經(jīng)藥物治療后都有不同程度的下降，其中以大劑量組的療效最優(yōu)，與醋酸潑尼松抗炎作用相當(dāng)，所以化痰活血降氣方可通過降低血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、ET-1的水平，減輕氣道炎癥反應(yīng)，并且ET-1分泌減少可以緩解肺血管收縮引起的肺部缺血缺氧，IL-β1分泌減少能夠減輕肺組織水腫，均能緩解COPD喘息、呼吸困難的癥狀。

綜上所述，化痰活血降氣方可以通過降低血清中TNF-α、IL-1β、ET-1水平，減輕氣道炎癥反應(yīng)，緩解肺血管收縮引起的缺血缺氧和肺組織水腫，降低肺臟指數(shù)，減輕COPD喘息、呼吸困難的癥狀，證實了化痰活血降氣方能通過減輕COPD的炎癥反應(yīng)，阻止病情加重。