金匱腎氣丸對(duì)甘油性急性腎衰竭大鼠腎功能的改善作用?

盧耿信 陳銳洲 肖珊珊 黃銳韻 林 俊 梁章煒 張尹州 指導(dǎo) 許小洋 王桂房

（廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 511436）

急性腎功能衰竭（ARF）是指由各種原因引起的腎功能在短期內(nèi)急劇下降，導(dǎo)致體內(nèi)代謝產(chǎn)物潴留，水/電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂的臨床綜合征[1]。外傷性和非外傷性橫紋肌溶解所致的ARF約占臨床所有ARF病例的15%～20%，且橫紋肌溶解性ARF透析治療效果欠佳，死亡率高[2]。目前，臨床上多采用連續(xù)腎臟替代療法（CRRT）來治療ARF患者[3]。但CRRT屬有創(chuàng)治療，易并發(fā)感染，且血液凈化技術(shù)費(fèi)用昂貴，一些偏遠(yuǎn)地區(qū)及基層醫(yī)院缺乏一定的設(shè)備條件，不能得到實(shí)際應(yīng)用。因此，從ARF的機(jī)制出發(fā)，通過某些藥物減輕腎單位的病變，加快腎單位的復(fù)原，促進(jìn)腎臟功能的恢復(fù)具有重要意義。

金匱腎氣丸是漢代張仲景《金匱要略》中之處方，是溫補(bǔ)腎陽的經(jīng)典方劑，用于腎陽虛之水腫，腰膝酸軟，小便不利，畏寒肢冷[4]?，F(xiàn)代研究顯示，金匱腎氣丸中主要成分如地黃、牡丹皮、車前子等具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)[5-6]。在ARF的發(fā)病機(jī)制中，由各種傷害性刺激導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞的缺血、缺氧和腎小管阻塞，進(jìn)而促使氧自由基增多、炎性因子釋放和細(xì)胞凋亡激活等是關(guān)鍵的發(fā)病環(huán)節(jié)[7]。鑒于金匱腎氣丸主要成分的上述功效，我們推測(cè)其可能在ARF的治療中發(fā)揮作用。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在甘油法復(fù)制ARF大鼠模型的基礎(chǔ)上，探究金匱腎氣丸對(duì)其干預(yù)效應(yīng)，以期為ARF的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為后續(xù)的深入研究奠定前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量200 g左右。大鼠飼養(yǎng)于溫度（26±4）℃，濕度（55±5）%動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2016-0168。動(dòng)物質(zhì)量合格證明號(hào)：No.44007200064708。動(dòng)物飼養(yǎng)在廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心設(shè)施內(nèi)進(jìn)行。

1.2 藥物 金匱腎氣丸（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，國藥準(zhǔn)字Z11020147），其主要成分為：地黃、山藥、酒萸肉、茯苓、牡丹皮、澤瀉、桂枝、附子（炙）、牛膝（去頭）、鹽車前子。輔料為蜂蜜。

1.3 試劑與儀器 肌酐測(cè)定試劑盒（苦味酸法，中生北控生物科技股份有限公司，YZB/京1735-2013）；磺基水楊酸（磺柳酸）；甘油；離心機(jī)（TDZ4-WS長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司）；722型可見分光光度計(jì)（Leng-Guang Tech）等。

1.4 分組與造模 將SD雄性大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成空白對(duì)照組（對(duì)照組）、急性腎功能衰竭模型組（腎衰組）和急性腎功能衰竭治療組（治療組），每組各8只，各組大鼠實(shí)驗(yàn)前禁水24 h，腎衰組和治療組以50%甘油按10 mL/kg分別在大鼠后肢肌肉注射，一般在2 h后出現(xiàn)血紅蛋白尿，48 h形成穩(wěn)定模型[8]。

1.5 給藥方法 于造模當(dāng)天開始給藥，給藥期間每組予以普通飼料及水飲食，治療組連續(xù)給金匱腎氣丸4 d，給藥方式為灌胃。灌胃前，先將金匱腎氣丸磨為粉末，稱重，參照文獻(xiàn)[9]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定本實(shí)驗(yàn)的給藥劑量為4.0 g/kg，用5 mL溫生理鹽水溶解后灌胃。灌胃采用16號(hào)灌胃針頭從大鼠的嘴角進(jìn)入，壓住舌頭，抵住上顎，輕向內(nèi)推進(jìn)，進(jìn)入食管后，有落空感，大約進(jìn)入5～6 cm，開始灌藥，每日1次。對(duì)照組和腎衰組每日予以同劑量生理鹽水灌胃1次。

1.6 檢測(cè)指標(biāo) 1）肌酐測(cè)定。各組大鼠均于給藥4 d后以10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血后，靜置離心，離心機(jī)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min，分離血清，按肌酐測(cè)定試劑盒的說明測(cè)血肌酐濃度。2）尿蛋白測(cè)定。4 d后磺基水楊酸法測(cè)尿蛋白，尿蛋白測(cè)定取少量尿液滴于玻片上，加4%磺基水楊酸2滴，觀察混濁與否及程度判斷尿蛋白的含量?！?”：減號(hào)為陰性，記-1分，說明無蛋白。加入試劑后，尿液仍清晰，在黑色背景時(shí)，仍看不到濁表現(xiàn)?！啊馈保杭訙p號(hào)，記0分，代表尿里有微量蛋白。加入試劑后出現(xiàn)白色輕度混濁，僅在黑色背景時(shí)可以看到?！?”：一個(gè)加號(hào)，記1分，代表尿里有中等量蛋白。加入試劑后，出現(xiàn)白色輕度混濁，無絮狀顆粒出現(xiàn)?！?+”：2個(gè)加號(hào)，記2分，代表尿里有較多量蛋白。加入試劑后，出現(xiàn)明顯白色混濁并出現(xiàn)顆粒狀沉淀。“+++”：3個(gè)加號(hào)，記3分，代表尿里有多量蛋白。加入試劑后，出現(xiàn)絮狀白色沉淀?！?+++”：4個(gè)加號(hào)，記4分，代表尿里有大量蛋白。加入試劑后，出現(xiàn)較大凝塊的白色沉淀。3）蛋白管型鏡檢。尿液離心（3 000 r/min），去上清，留沉淀約0.2 mL，輕搖離心管，充分搖勻，吸一滴于載玻片，制片，鏡下觀察（放大倍數(shù)10×40）。每份尿液樣本均滴于4張載玻片上，在鏡下取中間視野計(jì)算尿管型數(shù)，以4張載玻片總的尿管型數(shù)除以4作為該樣本尿管型的平均數(shù)，最后再計(jì)算每組均值并進(jìn)行組間比較。4）觀察腎臟皮髓質(zhì)紋理，計(jì)算腎/體質(zhì)量比?？v向剖開腎臟，觀察皮髓質(zhì)條紋、色澤，淤血情況，兩腎稱重，計(jì)算腎/體質(zhì)量比，腎/體質(zhì)量比=雙腎重/體質(zhì)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SigmaPlot12.5 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示。生存天數(shù)比較采用χ2檢驗(yàn)，組間計(jì)量數(shù)據(jù)的顯著性比較選用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生存曲線比較 見圖1。在實(shí)驗(yàn)期間死于腎衰竭的大鼠例數(shù)被視為完全病例，在實(shí)驗(yàn)期間死于與腎衰竭無關(guān)的原因或到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍存活的大鼠病例被視為刪失病例，采用Kaplan-Meier生存函數(shù)法并進(jìn)行Log Rank單因素生存分析，24只大鼠平均分為3組，造模當(dāng)天開始連續(xù)灌胃4 d后，對(duì)照組存活8只，腎衰組存活4只，治療組存活6只，實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組、腎衰組和治療組的平均生存期分別為（5.000±0.000）、（4.250±0.293）和（4.625±0.246）d，腎衰組的生存天數(shù)明顯比對(duì)照組短（χ2=4.998，P＜0.05），提示急性腎衰竭造模成功。治療組與腎衰組比較，生存天數(shù)有所增加但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.979，P＞0.05），可能與例數(shù)不足有關(guān)。

圖1 各組大鼠存活時(shí)間

2.2 各組大鼠血肌酐檢測(cè)水平比較 見圖2。各組SD大鼠中，對(duì)照組、腎衰組和治療組的血肌酐濃度分別為（48.13±11.76）、（169.75±41.58）和（116.67±26.14）μmol/L，腎衰組血肌酐濃度明顯比對(duì)照組高（t=7.62，P＜0.05），說明甘油導(dǎo)致的擠壓綜合征對(duì)SD大鼠腎臟造成腎衰竭，提示造模成功。治療組與腎衰組比較，血肌酐水平顯著降低（t=3.255，P＜0.05），提示金匱腎氣丸對(duì)腎臟功能具有保護(hù)作用。

圖2 金匱腎氣丸對(duì)腎衰大鼠血肌酐的影響

2.3 各組磺基水楊酸法尿蛋白檢查結(jié)果比較 見圖3。尿蛋白檢測(cè)結(jié)果為：對(duì)照組均為“-”；腎衰組3只為“+++”，1只為“++++”；治療組5只為“+”，1只為“++”。經(jīng)轉(zhuǎn)換為分值后的數(shù)據(jù)分別為：對(duì)照組（-1.000±0.000），腎衰組（3.25±0.500），治療組（1.330±0.408）。治療組尿蛋白的程度明顯比腎衰組低（t=9.156，P＜0.05），提示金匱腎氣丸具有修復(fù)濾過膜、減少蛋白質(zhì)濾過、保護(hù)腎單位的作用。

圖3 金匱腎氣丸對(duì)腎衰大鼠尿蛋白的影響

2.4 各組尿液鏡檢結(jié)果 見圖4。各組SD大鼠中，腎衰組尿液鏡檢發(fā)現(xiàn)有明顯蛋白管型（t=14.776，P＜0.05），說明擠壓綜合征對(duì)SD大鼠腎臟造成損傷。治療組尿液鏡檢也發(fā)現(xiàn)有明顯蛋白管型（t=5.164，P＜0.05），治療組與腎衰組比較，蛋白管型顯著減少（t=9.698，P＜0.05），提示金匱腎氣丸具有減少擠壓綜合征所致管型尿的作用。

圖4 各組大鼠鏡檢查結(jié)果比較（400倍）

2.5 各組腎臟縱向剖開圖和腎系數(shù)比較 見圖5。各組SD大鼠中，腎衰組與治療組的腎臟形態(tài)與對(duì)照組比較均有一定程度的病變。對(duì)照組腎形態(tài)大小正常；腎衰組腎臟明顯變大，質(zhì)量變重，皮質(zhì)缺血，髓質(zhì)淤血；治療組腎臟與腎衰組相比有所減小，皮質(zhì)正常，髓質(zhì)淤血與腎衰組比較無明顯差異（圖5）。腎衰組與對(duì)照組相比，腎/體質(zhì)量比明顯增大（t=4.236，P＜0.05）治療組與對(duì)照組相比，腎/體質(zhì)量比也明顯增大（t=3.397，P＜0.05），治療組比腎衰組腎/體質(zhì)量比略有減小，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=1.177，P＞0.05）（表1）。提示金匱腎氣丸在此時(shí)間段內(nèi)尚不具備完全逆轉(zhuǎn)腎臟病理改變的作用。

圖5 各組大鼠腎臟縱向剖開圖比較

3 討 論

急性腎功能衰竭是多種病因引起的急性腎損害，使腎小球過濾下降，機(jī)體電解質(zhì)、酸堿失衡，出現(xiàn)代謝酸中毒、高血鉀的癥狀[12]。急性腎衰竭可由全身性嚴(yán)重感染（如膿毒血癥）[13]以及腎臟本身的功能障礙導(dǎo)致，如腎血管收縮、腎小球病變、腎小管阻塞、腎小管原尿回漏入間質(zhì)等[1]。甘油法致大鼠急性腎衰竭模型中，甘油法導(dǎo)致的擠壓綜合征引起橫紋肌溶解，從肌細(xì)胞中釋放出肌紅蛋白，經(jīng)腎小球?yàn)V過后，在腎小管沉淀堵塞，并損傷腎小管。另外，腎小球及腎小管周圍纖維蛋白沉積，血管內(nèi)血淤積，血栓形成，血流不暢，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率下降，腎小管壞死[8]。

表1 各組大鼠腎/體質(zhì)量比較（±s）

表1 各組大鼠腎/體質(zhì)量比較（±s）

與對(duì)照組比較，?P＜0.05；正常雄性大鼠腎/體質(zhì)量比為0.73～0.97

組別對(duì)照組腎衰組治療組n846腎質(zhì)量（g）1.77±0.30 2.71±0.60*2.51±0.56*體質(zhì)量（g）205.13±17.78 198.13±16.39 204.50±17.20腎/體質(zhì)量比0.86±0.10 1.36±0.28*1.22±0.22*

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)急性腎衰竭大鼠使用金匱腎氣丸，探究其對(duì)腎衰竭腎功能的改善情況。研究顯示急性腎功能衰竭伴有嚴(yán)重的生化指標(biāo)紊亂，表現(xiàn)為血肌酐等代謝廢物水平的升高，同時(shí)伴有尿蛋白、蛋白管型等病理表現(xiàn)。血肌酐是肌酸代謝產(chǎn)物，由腎臟排出，其水平的升高反映腎臟的濾過功能下降[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用甘油肌肉注射可導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生明顯的急性腎功能損傷，腎衰組大鼠4 d后死亡4只，金匱腎氣丸灌服可顯著降低死亡數(shù)量（死亡2只）。結(jié)果說明金匱腎氣丸對(duì)甘油所致急性腎衰竭的腎功能有改善作用。

治療組與腎衰組比較，血肌酐水平顯著降低，提示金匱腎氣丸對(duì)腎臟功能具有保護(hù)作用，這可能與金匱腎氣丸中地黃、丹皮酚、車前子等成分有關(guān)。現(xiàn)代藥理研究表明，地黃有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)[6]；丹皮酚有抗氧化、抗炎抗菌等方面的藥理活性[7]；車前子有利尿、消炎、抗氧化方面的藥理活性[14]。這些藥物可能對(duì)損傷腎單位有保護(hù)與修復(fù)作用，使血肌酐等代謝廢物得以排出。尿蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，治療組的尿蛋白水平明顯比腎衰組低，說明金匱腎氣丸具有保護(hù)腎單位、減少蛋白質(zhì)濾出的作用。其機(jī)制可能與藥物抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的活化、抑制炎癥因子過度釋放，從而下調(diào)損傷的腎單位的炎癥水平有關(guān)[15-17]；也有可能與本方在急性腎衰竭大鼠中，促進(jìn)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、核因子-κB、血紅素加氧酶-1和硝基酪氨酸的表達(dá)增加有關(guān)[18]。治療組與腎衰組比較，蛋白管型雖仍存在但數(shù)目顯著減少，提示金匱腎氣丸具有減少擠壓綜合征所致管型尿的作用，但在實(shí)驗(yàn)期間未見其有消除蛋白管型作用，其機(jī)制可能與上述藥物對(duì)部分腎小管的修復(fù)和保護(hù)功能有關(guān)。治療組與腎衰組比較，腎系數(shù)略有減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示金匱腎氣丸在較短的時(shí)間內(nèi)尚不能逆轉(zhuǎn)腎臟的病理變化。

由于本研究為醫(yī)學(xué)本科生的課外探索性實(shí)驗(yàn)，受各種條件的限制，實(shí)驗(yàn)尚缺分子機(jī)制的探討，這部分內(nèi)容有待進(jìn)一步深入，但本研究為后續(xù)對(duì)金匱腎氣丸改善急性腎衰竭機(jī)制的探討提供了前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，金匱腎氣丸對(duì)急性腎衰竭腎功能具有一定的改善作用，至于金匱腎氣丸對(duì)抗急性腎衰竭的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的探討。