基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討乳積方治療三陰性乳腺癌的作用機理

戴黎穎， 陳學(xué)彰， 李宏良， 陳錫康， 田華琴

廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山中醫(yī)院腫瘤中心，廣東 佛山 528000

三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2均為陰性表達的乳腺癌，易發(fā)生術(shù)后轉(zhuǎn)移，惡性程度高，預(yù)后差。而中醫(yī)藥在乳腺癌的治療上有獨特的優(yōu)勢，如改善生活質(zhì)量，降低毒副反應(yīng)以及增強療效等作用[1]。乳積方(北柴胡、白芍、黨參、山慈菇、海藻、瓜蔞、浙貝母、預(yù)知子，王不留行）是廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山中醫(yī)院腫瘤中心用以治療乳腺癌的經(jīng)驗方。整張方著眼于乳腺癌肝郁氣滯、痰毒蘊結(jié)的病機特點，從疏肝健脾，清熱散結(jié)角度進行處方布局。方中柴胡疏肝理氣、升舉陽氣，為君藥；配伍白芍合養(yǎng)血柔肝，黨參補益肺脾，扶助正氣，為臣藥；浙貝母、山慈菇、海藻，化痰散結(jié)；瓜蔞清熱滌痰開胸，預(yù)知子疏肝理氣、活血止痛；王不留行活血通經(jīng)，是為佐藥[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，乳積方制劑對人乳MDA-MB-231細胞具有增殖抑制作用，能增效減毒以及降低乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率[3-7]，但乳積方治療TNBC的作用機制還有待深入研究。

本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法提取、分析乳積方成分、作用靶點和分子通路等，進而探討乳積方治療TNBC可能的機制，為研究其作用機制的相關(guān)實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 乳積方主要化學(xué)成分收集

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索乳積方9味中藥的化學(xué)成分。設(shè)定各中藥生物利用度(bioavailability，OB）≥30%，類藥性(drug-likeness，DL）≥0.18。篩選出各藥物有效成分(ingredients），并根據(jù)篩選出來的有效成分過濾其對應(yīng)的靶基因(Related Targets）。

通用蛋白資源(Universal Protein Resource，UniProt，https：//www.uniprot.org）是一個高數(shù)據(jù)量、高質(zhì)量的蛋白質(zhì)序列與功能信息數(shù)據(jù)庫，可將TCMSP中獲取的藥物靶基因名稱轉(zhuǎn)化為UniProt數(shù)據(jù)庫中基因所對應(yīng)的名稱。

1.2 TNBC疾病靶點的篩選

使用在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man， OMIM， http：//omim.org）、Gencards數(shù)據(jù)庫(http：//www.genecards.org）檢索“TNBC”以及“Triple negative breast cancer”，獲取TNBC疾病基因。

1.3 藥物-活性成分-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用R軟件“VennDiagram”程序包，取乳積方藥物靶基因和疾病靶點的交集，繪制韋恩圖；使用Cytoscape(Version3.7.2）制作TNBC-乳積方-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 構(gòu)建乳積方-TNBC交集靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org）是一個基因、蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的檢索網(wǎng)。將乳積方和TNBC交集基因?qū)氲綑z索框中，選擇“homo sapines”進行分析。設(shè)定P＜0.05作為篩選條件，設(shè)置“隱藏游離點”、交互分數(shù)最低值為0.9，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI network）分析結(jié)果。下載該TSV文件，對PPI網(wǎng)絡(luò)中交集靶點度值進行統(tǒng)計，遴選出該網(wǎng)絡(luò)的核心基因。

1.5 基因本體論(GO）分析和KEGG通路富集分析

Bioconductor(https：//www.bioconductor.org）是一個分析分子生物學(xué)實驗產(chǎn)生的基因組數(shù)據(jù)的軟件。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia ofGenesandGenomes， KEGG， https：//www.genome.jp/kegg/）是一個綜合數(shù)據(jù)庫，整合了基因組信息、化學(xué)信息和生化系統(tǒng)功能信息，其通路數(shù)據(jù)子數(shù)據(jù)庫(PATHWAY）記錄的是細胞分子相互作用網(wǎng)絡(luò)以及具體生物所特有的變化形式。

從Bioconductor下載R語言的相應(yīng)程序包[8，9]，使用R軟件進行GO分析和KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 乳積方中活性成分及靶點的獲取和篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索，篩選出活性成分柴胡17個，白芍13個，黨參21個，山慈菇3個，瓜蔞11個，浙貝母7個，海藻4個，預(yù)知子6個，王不留行4個，共計86個，排除重復(fù)成分后，整理如表1。

表1 乳積方中有效成分信息Table 1 Information of effective ingredients in Rujifang

（續(xù)表1）

根據(jù)活性成分結(jié)果，從TCMSP下載相應(yīng)活性對應(yīng)的靶點數(shù)據(jù)，共檢索到藥物靶點柴胡349個，白芍112個，黨參214個，山慈菇29個，瓜蔞35個，浙貝母70個，海藻174個，預(yù)知子44個，王不留行193個。將上述靶點在Uniprot數(shù)據(jù)庫進行比對，共取得靶點196個。

2.2 乳積方治療TNBC的潛在靶點預(yù)測

使用GeneCards及OMIM進行TNBC相關(guān)基因篩選，共獲得基因靶點3 751個，排除重復(fù)基因靶點，共收集到3 724個；使用R軟件(3.6.1）VennDiagram包繪制藥物活性成分靶點與TNBC疾病靶點的韋恩圖，結(jié)果如圖1，共有156個基因重疊。

圖1 乳積方藥物靶點與TNBC疾病靶點交集韋恩圖（藍色圓框為疾病靶點，紅色圓框為藥物靶點）Figure 1 Venn diagram of Rujifang drug targets and TNBC disease targets（The blue circle means the Disease target and the red circle means the Drug target）

2.3 疾病-方劑-藥物有效成分-作用靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

使用Cytoscape軟件構(gòu)建疾病-方劑-藥物有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)。將乳積方86個分子有效成分和156個關(guān)鍵基因?qū)隒ytoscape，如圖2所示。在乳積方-作用靶點的網(wǎng)絡(luò)中，有效成分quercetin(槲皮素）度值最高，達708，如表2?；騈COA2表達度值最高，達39，如表3。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)絡(luò)）構(gòu)建

圖2 TNBC-乳積方-藥物有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖（紫色方框為作用靶點，淡紅色菱形為有效成分）Figure 2 Network of TNBC-Rujifang-effective ingredients-action targets （purple box means action targets，light red diamond means effective ingredients）

表2 Cytoscape網(wǎng)絡(luò)中疾病關(guān)鍵靶基因度值前5位的乳積方有效成分Table 2 The effective ingredients of Rujifang in the top 5 of the target gene degree in Cytoscape network

將上述156個重疊基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫獲取蛋白質(zhì)，得到交互文件，得到圖3。下載TSV文件，統(tǒng)計度值前20位基因靶點，繪制柱狀圖，如圖4，縱坐標為基因名，橫坐標表示其度值，最大的JUN度值為34，其次為MAPK1、AKT1、RELA、IL6、 MAPK8、 APP、 ESR1、 MAPK14、 CXCL8。上述蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位，是乳積方治療TNBC的關(guān)鍵基因。度值越大，代表其為核心基因的可能性最大。

2.5 關(guān)鍵靶點基因生物功能及通路分析

GO分析提示，乳積方的80個關(guān)鍵靶點基因主要的生物學(xué)功能有protein heterodimerization activity(蛋白異源二聚體作用），proximal promoter sequence-specific DNA binding(近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合），RNA polymeraseⅡproximal promoter sequence-specific DNA binding(RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合）和chromatin binding(染色質(zhì)綁定）。說明乳積方治療TNBC可以通過上述生物學(xué)功能參與多種生物調(diào)控而發(fā)揮作用。

表3 Cytoscape網(wǎng)絡(luò)中乳積方有效成分度值前8位的TNBC基因Table 3 TNBC gene in the top 8 of effective ingredients of Rujifang in Cytoscape network

圖3 乳積方與TNBC重疊靶點基因的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of overlapping target genes of Rujifang and TNBC

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點基因度值前20位Figure 4 Top 20 in PPI network of target genes degree

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集結(jié)果顯示，乳積方治療TNBC的關(guān)鍵基因靶點主要富集的通路有：PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、Apoptosis信號通路、細胞凋亡信號通路。并且與乙型肝炎、人類巨細胞病毒感染、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染，癌癥的蛋白聚糖和動脈粥樣硬化的MicroRNAs上調(diào)、下調(diào)有相關(guān)性，如圖6、表4。

3 討論

本研究結(jié)果顯示乳積方中槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇和木犀草素度值大，說明上述成分在乳積方治療TNBC中發(fā)揮了重要作用，其中槲皮素、山柰酚均為黃酮類化合物。槲皮素在柴胡中的量高達4.708 1 mg/g。山奈酚為白芍重要的有效成分，臨床中柴胡、白芍經(jīng)常作為藥對使用以疏肝解郁。在一項對黃酮類化合物的藥理研究中發(fā)現(xiàn)，其具有抗抑郁、抗腫瘤等藥理活性[10，11]。這和乳腺癌病因病機中的“情志內(nèi)傷”、“沖任失調(diào)”相呼應(yīng)[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能誘導(dǎo)包括雌激素受體陽性乳腺癌細胞在內(nèi)的9種腫瘤細胞系的細胞凋亡，使小鼠的腫瘤體積顯著減少[13]。低劑量的山奈酚能通過阻斷RhoA和Rac1信號通路，抑制TNBC細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[14]。β-谷甾醇是山慈菇的主要有效成分，其對乳腺癌細胞具有較強的抗增殖活性[15]。木犀草素能降低乳腺癌細胞株的活力，加速細胞凋亡，提高miR-203的表達，而miR-203的表達與木犀草素的抗腫瘤作用呈正相關(guān)[16]。

圖5 關(guān)鍵靶點生物學(xué)功能富集圖Figure 5 Enrichment diagram of biological functions of key targets

表4 KEGG富集結(jié)果計數(shù)前5位Table 4 Top 5 of KEGG enrichment result

蛋白互助網(wǎng)絡(luò)顯示JUN、MAPK1、AKT1、RELA、IL6、MAPK8等靶點基因度值大，說明其在乳積方治療TNBC機制中有重要作用。JUN屬轉(zhuǎn)錄因子AP-1的亞家族，參與基因調(diào)節(jié)，促進細胞增殖[17]。在體外實驗中，JUN表達可以促進新生小鼠的肝臟體積增長[18]。本研究GO分析提示，JUN可能通過蛋白異源二聚體和近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合發(fā)揮作用；AKT1屬于AKT家族，同時AKT也是屬于PI3K/Akt信號通路的節(jié)點分子，在乳腺腫瘤中以異?；罨问酱嬖冢龠M腫瘤細胞的生長及增殖。一些針對AKT的小分子抑制劑，如Afuresertib、AZD5363、MK2206已作為抗癌藥進入到臨床試驗階段[19]?；罨腁KT可以調(diào)節(jié)一系列與細胞增殖相關(guān)的蛋白，如P65(即RELA），從而參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。RELA屬于NF-κB家族，其激活與惡性腫瘤的發(fā)展呈正相關(guān)。IL6在晚期癌癥中通常屬于高表達，通過上調(diào)PIM1促進乳腺癌細胞的侵襲[21，22]。MAP激酶是多種生化信號的整合點，參與多種細胞過程如增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育等[23]。上述研究報道與本研究結(jié)果相符。

圖6 KEGG富集通路氣泡圖Figure 6 Bubble diagram of KEGG enrichment pathway

PI3K/Akt信號通路為本研究發(fā)掘出的乳積方治療TNBC最重要通路。有效成分β-谷甾醇可通過調(diào)節(jié)PI3K通路參與抗癌，核心靶點AKT1屬于PI3K/Akt信號通路的節(jié)點分子，KEGG富集結(jié)果也提示PI3K-Akt信號通路出現(xiàn)頻次最高。由此可見PI3K通路是乳積方治療TNBC的一條重要通路。其可由不同細胞刺激物或毒素激活，參與腫瘤的增殖、分化、凋亡等過程，也能通過VEGF等相互作用，促進腫瘤血管新生；與下游CCND1相互作用，干擾細胞周期；與其下游的MAPK相作用，可導(dǎo)致細胞增殖[24，25]。PI3K/Akt通路在中醫(yī)藥治療乳腺癌領(lǐng)域的研究尚少，主要集中在HER-2陽性乳腺癌，均為單藥或者復(fù)方對該通路的下調(diào)作用研究[26-28]。

綜上，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對乳積方有效成分、相關(guān)靶點、疾病蛋白和作用通路等進行梳理，發(fā)現(xiàn)乳積方治療TNBC機制為多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用。由于數(shù)據(jù)庫的完整性、數(shù)據(jù)篩選的規(guī)范性不統(tǒng)一，所以本研究結(jié)果僅作為參考，為下一步基礎(chǔ)實驗提供一個可能的方向。