基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探究桂枝茯苓丸治療卵巢癌的潛在機制

何燦封， 肖志偉

1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

卵巢癌(ovarian cancer，OC）是婦科常見的腫瘤，其年發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中排第3位，但復發(fā)率和死亡率位于女性生殖道惡性腫瘤首位。由于卵巢處于盆腔深部，病變早期無明顯特異性癥狀，約70%患者就診時已處于晚期，并伴有下腹不適、腹脹、食欲下降、消瘦、乏力等癥狀，多由腫塊增大或盆腹腔大量積液所導致。手術(shù)和含鉑方案化療是目前OC治療的主要手段，但仍有約70%的晚期OC患者會出現(xiàn)復發(fā)，并出現(xiàn)鉑類藥物耐藥性[1]。復發(fā)性O(shè)C絕大多數(shù)無法治愈，其治療多為在改善癥狀、提高生活質(zhì)量目的下的姑息性治療，故預(yù)防OC復發(fā)和逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥是目前臨床中值得關(guān)注的問題。

卵巢癌屬于中醫(yī)學的“癥瘕”范疇。《諸病源候論》云：“其病不動者，直名為癥。若雖病有結(jié)癥而可推移者，名為癥瘕?！惫鹬蜍咄?Guizhi Fuling Pill）出自《金匱要略》，書中記載該方主治妊娠婦人宿有癥病。此方由桂枝、茯苓、桃仁、赤芍、牡丹皮等5味藥組成，方中桂枝可溫通經(jīng)脈、活血通絡(luò)，茯苓淡滲，可助行瘀血，桃仁破血行血、去瘀生新，而宿有癥塊，久則化熱，合赤芍、牡丹皮之微寒，可散瘀清熱，諸藥合用，有活血化瘀、緩消癥塊之功。桂枝茯苓丸臨床上廣泛用于多種婦科腫瘤治療，可發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)機體免疫和內(nèi)分泌等作用[2，3]。

為了進一步探究桂枝茯苓丸治療卵巢癌的潛在機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法篩選出桂枝茯苓丸有效成分及作用靶點，通過分子功能及通路富集分析等預(yù)測其作用機制，并使用分子對接技術(shù)研究核心成分及核心靶點的相互作用，以期為桂枝茯苓丸的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為今后深入的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 收集桂枝茯苓丸的活性成分及靶點

從中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， TCMSP， http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）中收集桂枝、茯苓、桃仁、赤芍、牡丹皮的成分，根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性(drug-likeness，DL）≥0.18 篩選出活性成分[4，5]，并收集其相應(yīng)靶點，刪除不含有靶點的活性成分。通過通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(universal protein，Uniprot，http：//www.uniprot.org）將收集的靶點轉(zhuǎn)化為基因名稱，物種來源限制為人(“Homo sapiens”），刪除物種來源不符合人的靶點。

1.2 收集桂枝茯苓丸治療OC的潛在靶點

在人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards(https：//www.genecards.org）檢索“ovarian cancer”相關(guān)的疾病靶點，與TCMSP中收集到的桂枝茯苓丸靶點取交集后，最終獲得桂枝茯苓丸治療OC的潛在靶點。

1.3 構(gòu)建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape軟件(版本3.7.1）構(gòu)建桂枝茯苓丸治療OC的“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，同時采用CytoNCA插件對該網(wǎng)絡(luò)進行核心成分分析。連接度(degree，即節(jié)點間相連的路徑數(shù)目，可體現(xiàn)節(jié)點的重要程度）值排名前3[6]的活性成分被認為是桂枝茯苓丸治療OC的核心成分。

1.4 基因本體論(Gene Ontology，GO）分子功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

R語言中的clusterProfiler包是用于基因功能以及通路富集分析和可視化的軟件包。在R語言(版本3.6.1）中調(diào)用clusterProfiler包對桂枝茯苓丸治療OC的靶點進行GO分子功能和KEGG通路富集分析，篩選條件為P＜0.001。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI）

將桂枝茯苓丸治療OC的靶點導入蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析平臺STRING數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/），物種限制為人(“Homo sapiens”），構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，下載該網(wǎng)絡(luò)并導入至Cytoscape軟件，采用CytoNCA插件對該網(wǎng)絡(luò)進行核心靶點分析，degree值排名前3[6]的靶點被認為是桂枝茯苓丸治療OC的核心靶點。

1.6 分子對接

使用分子對接技術(shù)探究桂枝茯苓丸核心成分與核心靶點之間的相互作用，具體為分別從PDB網(wǎng)站(http：//www.rcsb.org/）和pubchem網(wǎng)站(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載靶蛋白結(jié)構(gòu)及核心成分的3D結(jié)構(gòu)，使用AutoDock軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進行去水、加氫及計算電荷處理后，以蛋白自帶配體為中心構(gòu)建對接口袋。如蛋白無自帶配體，則使用CB-Dock在線分子對接網(wǎng)站(http：//cao.labshare.cn/cb-dock/）預(yù)測對接口袋[7]。確定對接口袋坐標參數(shù)后，使用AutoDock Vina軟件進行分子對接和構(gòu)象打分。使用R語言“heatmap”包根據(jù)對接結(jié)果分值繪制熱圖，并使用Pymol軟件對上述對接結(jié)果中Vina對接分值最佳的受體-配體結(jié)構(gòu)進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 桂枝茯苓丸的活性成分及作用靶點

在TCMSP中根據(jù)閾值OB≥30%和DL≥0.18含有靶點檢索篩選桂枝、茯苓、桃仁、赤芍、牡丹皮的有效成分，去除重復成分后，共篩選出符合條件的活性成分43個，詳見表1。將活性成分相應(yīng)靶點的名稱通過Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為基因名稱，剔除重復及非人類靶點后，共獲得212個潛在靶點。

2.2 桂枝茯苓丸治療OC的潛在靶點

檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫得到與OC相關(guān)的靶點共2 508個，與桂枝茯苓丸活性成分的作用靶點取交集后，最終獲得桂枝茯苓丸治療OC的潛在靶點共120個，詳見圖1和表2。

2.3 構(gòu)建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape軟件繪制桂枝茯苓丸治療OC的“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖2。該圖直觀反映了桂枝茯苓丸多成分、多靶點治療OC的作用機制。CytoNCA插件分析表明，degree值排名前3的活性成分依次為Quercetin(槲皮素）、Kaempferol(山奈酚）、Baicalein(黃芩素），可認為是桂枝茯苓丸治療OC的核心成分。

2.4 GO分子功能富集結(jié)果

clusterProfiler包對上述120個潛在靶點基因的GO分子功能富集結(jié)果表明，桂枝茯苓丸治療OC中所調(diào)節(jié)的分子功能主要涉及細胞信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄和抗氧化等方面，詳見圖3。

2.5 KEGG通路富集結(jié)果

使用clusterProfiler包對上述120個潛在靶點基因的KEGG通路富集分析表明，在P值排名前50條通路中，與OC相關(guān)的通路有絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB or PI3K/Akt）信號通路，人乳頭瘤病毒感染，白介素17(interleukin-17，IL-17）信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF）信號通路、細胞凋亡、內(nèi)分泌耐藥、輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17）細胞分化，低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路，叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O(forkhead box O，F(xiàn)oxO）信號通路，癌癥中細胞程序性死亡配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1）表達和細胞程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1）檢查點途徑，T細胞受體信號通路，表皮因子生長受體(epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥、Toll樣受體信號通路，p53信號通路，鉑類藥物耐藥、ErbB信號通路。詳見圖4。

表1 桂枝茯苓丸活性成分的具體信息Table 1 Concrete information about active ingredients of Guizhi Fuling Pill

圖1 桂枝茯苓丸治療OC靶點的篩選Figure 1 Screening of targets for OC treated by Guizhi Fuling Pill

圖2 桂枝茯苓丸治療OC的中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Herb-active ingredient-target network of Guizhi Fuling Pill for OC

圖3 GO分子功能富集Figure 3 Enrichment of GO molecular function

表2 桂枝茯苓丸治療OC的潛在靶點Table 2 Information about potential targets for OC of Guizhi Fuling Pill

2.6 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

使用STRING網(wǎng)站和Cytoscape軟件對桂枝茯苓丸中治療OC的120個靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，CytoNCA插件分析顯示degree值排名前3的靶點依次為：蛋白激酶B(protein kinase B，PKB or AKT1），白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA），這些可認為是桂枝茯苓丸治療OC的靶點互作網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點，詳見圖5。

2.7 分子對接

分子對接結(jié)果顯示，槲皮素、山奈酚、黃芩素等3個核心成分與AKT1、IL-6、VEGFA等3個核心靶點對接的Vina分值≤-9.0有3對，均來自核心成分與AKT1的對接，表明AKT1很可能是桂枝茯苓丸治療OC的潛在靶點，具體對接結(jié)果見圖6，其中AKT1蛋白與黃芩素相互作用的Vina分值(即結(jié)合能）最佳，為-9.80kcal/mol。結(jié)合圖7可以看出，黃芩素與AKT1蛋白之間通過5個氫鍵、4個π-烷基疏水鍵和5個π-π鍵成較穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法和分子對接技術(shù)對桂枝茯苓丸治療OC的潛在治療機制進行了探索，構(gòu)建中藥-活性成分-靶標網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)表明了桂枝茯苓丸治療OC具有多成分、多靶點綜合作用的特點，該網(wǎng)絡(luò)的核心化合物為槲皮素、山奈酚和黃芩素。三者屬于植物黃酮類化合物，多項研究發(fā)現(xiàn)其對于OC細胞具有抑制腫瘤生長及血管生成、干擾細胞周期和誘導細胞凋亡、增強放化療療效等作用[8-12]。

圖4KEGG通路富集Figure 4 Enrichment of KEGG pathway

圖5 桂枝茯苓丸中治療OC靶點的互作網(wǎng)絡(luò)Figure 5 Network of interactions among targets for OC in Guizhi Fuling Pill

圖6 分子對接結(jié)果Figure 6 Results of molecular docking

圖7 AKT1蛋白與黃芩素之間相互作用的3D示意圖Figure 7 3D diagram of interaction between AKT1 protein and Baicalein

桂枝茯苓丸治療OC的靶點互作網(wǎng)絡(luò)直觀體現(xiàn)了靶點間的相互作用，該網(wǎng)絡(luò)的核心靶點為AKT1、IL-6和 VEGFA。AKT1(即 AKT）是 PI3K/AKT通路的重要靶標，磷酸化激活的AKT1通過其激酶活性作用于多個下游靶標，如mTOR、FoxO等，發(fā)揮調(diào)控細胞的增殖和凋亡、細胞周期、細胞代謝、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄以及血管生成等作用，異?；罨腁KT可逃避細胞凋亡，促使細胞存活，與腫瘤發(fā)生相關(guān)[13，14]。研究表明，外源性AKT1促進OC細胞遷移和侵襲，靶向抑制AKT1的表達，可抑制OC細胞生長和侵襲[15，16]。此外，AKT1還與OC化療耐藥的發(fā)生有關(guān)[17]。IL-6是一種多效炎性因子，是細胞因子級聯(lián)反應(yīng)中的核心介質(zhì)，參與調(diào)節(jié)炎癥與免疫反應(yīng)，此外，IL-6還與破骨細胞形成有關(guān)。IL-6介導的IL-6/STAT3信號通路在OC發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用[18]。OC組織分泌IL-6影響PI3K/AKT、Ras/MAPK和JAK/STAT等通路，可促使腫瘤細胞增殖、逃避凋亡和血管生成，還可誘導化療耐藥[19，20]。VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子家族成員，在卵巢癌組織中存在高表達，通過作用于血管內(nèi)皮細胞，介導血管的通透性，誘導腫瘤血管生成，并可促進細胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲，抑制細胞凋亡及促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[21，22]。分子對接表明桂枝茯苓丸的核心成分與上述核心靶點之間有較好的結(jié)合作用，其中AK1與黃芩素、槲皮素、山奈酚的相互作用較佳，提示AK1很可能是桂枝茯苓丸核心成分干預(yù)的靶點。

本研究還識別了桂枝茯苓丸治療OC的靶點所干預(yù)的分子功能及疾病通路，分子功能調(diào)節(jié)主要集中為細胞信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄、抗氧化等方面。通路富集結(jié)果中與OC治療相關(guān)的潛在通路可進一步歸納為以下幾方面：①細胞增殖：ErbB信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路；②細胞凋亡：p53信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路；③血管生成：HIF-1信號通路；④腫瘤免疫：IL-17信號通路、Th17細胞分化、Th1和Th2細胞分化、T細胞受體信號通路、癌癥中PD-L1表達和PD-1檢查點途徑、Toll樣受體信號通路；⑤耐藥性：鉑類藥物耐藥、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥和內(nèi)分泌耐藥；⑥人乳頭瘤病毒感染。

本研究從分子水平揭示了桂枝茯苓丸治療OC是多成分、多靶點、多通路綜合的作用模式，結(jié)合核心靶點功能與通路富集結(jié)果，推測桂枝茯苓丸治療OC的機制很可能涉及細胞增殖、細胞凋亡、血管生成、腫瘤免疫、耐藥性和人乳頭瘤病毒感染等方面，雖然目前尚無相關(guān)文獻研究報道，但這可為今后進一步闡明桂枝茯苓丸治療OC的具體機制提供思路，也可為臨床應(yīng)用桂枝茯苓丸治療OC提供一定參考依據(jù)。