二倍體馬鈴薯綠原酸的提取與光譜測(cè)定分析

楊慧芹，張 博，馬 玲，尚 軼，高冬麗*

1. 云南省馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500 2. 云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院，云南 昆明 650500

引 言

馬鈴薯(Solanum tuberosum)是一年生茄科植物，其塊莖營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含淀粉、蛋白質(zhì)、糖類及多種維生素和無(wú)機(jī)鹽，是繼水稻和小麥之后的世界第三大糧食作物。 我國(guó)是馬鈴薯最大的生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，2015年農(nóng)業(yè)部啟動(dòng)了馬鈴薯主糧化、主食化戰(zhàn)略后，馬鈴薯成為我國(guó)第四大糧食作物。 馬鈴薯不僅營(yíng)養(yǎng)成分全面、營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)合理、易于消化吸收，且所含多酚類物質(zhì)具有多種保健作用。 馬鈴薯塊莖中總酚含量以干重計(jì)在0.11%～0.13%之間，芽中含量高達(dá)0.18%，其中約90%是綠原酸(chlorogenic acid，CGA)[1]。 綠原酸為馬鈴薯次生代謝過(guò)程產(chǎn)生的一種重要的有機(jī)酸，對(duì)自由基的清除和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用顯著，具有抗菌、抗病毒、抗誘變及抗癌、降脂降糖、降血壓、保護(hù)心血管等多種藥用功能[2-3]。

綠原酸又稱咖啡單寧酸，化學(xué)名為3-O-咖啡?？崴?3-O-caffeoylquinic acid)，分子式為C6H18O9，最早于1897年由Osbome和Campbell首次在向日葵種子中發(fā)現(xiàn)。 植物中綠原酸的生物合成途徑有三條[4]，如圖1所示。 其中，通過(guò)HQT(奎尼酸羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶)合成綠原酸的途徑是其主要的合成途徑[5-7]。

馬鈴薯作為一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的的保健食品，已成為世界各國(guó)飲食和烹飪文化中不可或缺的一部分，且高綠原酸含量的馬鈴薯品種有較大的市場(chǎng)需求，但目前馬鈴薯的栽培品種中綠原酸含量普遍較低，且不同栽培品種之間的含量差異性較大[8-9]，因而開(kāi)展如何提高馬鈴薯中的綠原酸含量的研究具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。 本文利用豐富的二倍體馬鈴薯資源，并對(duì)其葉片、薯皮、薯肉的綠原酸含量進(jìn)行了測(cè)定分析，為研究、培育出綠原酸含量高、風(fēng)味好的馬鈴薯新品種提供研究基礎(chǔ)。

圖1 植物中綠原酸的三條生物合成途徑 途徑1用綠色箭頭標(biāo)示，途徑2用藍(lán)色箭頭標(biāo)示， 途徑3用紅色箭頭標(biāo)示； 重要的合成酶標(biāo)記為紅色Fig.1 Three biosynthetic pathways of chlorogenic acid in plants pathway 1 is marked by a green arrow; pathway 2 by a blue arrow; pathway 3 by a red arrow; Important synthases are labeled red

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料采集于云南師范大學(xué)馬鈴薯實(shí)驗(yàn)基地，均為二倍體材料。 其中，C系列為全世界范圍內(nèi)收集的自然變異群體，151系列和RH系列為從國(guó)際馬鈴薯中心引進(jìn)的高度雜合、且自交親和的C151和RH的自交分離F2群體。

1.2 綠原酸的提取

馬鈴薯葉片選取植株頂端完全展開(kāi)、狀態(tài)良好、無(wú)病變的適量新鮮葉片(FW)，用液氮研磨成粉末； 馬鈴薯薯塊選擇大小均一、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)綠變、新鮮的馬鈴薯，用水清洗除去表面污物，去皮切片(盡量縮短其在空氣中的暴露時(shí)間，避免發(fā)生氧化)，液氮速凍后用真空冷凍干燥機(jī)凍干(DW)，研磨至粉末狀； 馬鈴薯薯皮收集后經(jīng)液氮速凍后用真空冷凍干燥機(jī)凍干，研磨至粉末狀。 稱取適量粉末放入離心管中，加入75%乙醇(提取液)，4 ℃超聲波震蕩萃取、離心，經(jīng)0.22 μmol·L-1微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾的上清液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，-80 ℃保存。

1.3 綠原酸的測(cè)定與分析

采用ALPHA1-2LD plus 凍干機(jī)制備凍干樣； 采用2800UV-VIS分光光度計(jì)測(cè)定綠原酸[10-11]，75%乙醇為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)為327 nm下測(cè)定吸光度(綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜見(jiàn)圖2)并計(jì)算綠原酸含量； 采用SPSS16.0對(duì)各系列綠原酸測(cè)定值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，平均值(Mean)，全距(Range)，方差(Variance) 數(shù)值，標(biāo)準(zhǔn)差(Std. Deviation) ，最大值(Max)。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸收光譜Fig.2 Absorption spectrum of chlorogenic acid standards

2 結(jié)果與討論

通過(guò)對(duì)C系列，151系列和RH系列新鮮功能葉片中間部位的綠原酸提取液進(jìn)行吸收光譜分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 馬鈴薯葉片綠原酸吸收光譜圖(提取液稀釋35倍)

圖4 馬鈴薯葉片綠原酸的含量Fig.4 Content of chlorogenic acid in potato leaves

由圖3可知，在波長(zhǎng)為327 nm時(shí)，C系列的吸收值最高，其次為151系列，RH系列的吸收值最低。 對(duì)C系列，151系列和RH系列各131個(gè)樣本中葉片的綠原酸含量進(jìn)行光譜測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。

結(jié)合圖3和圖4可知，二倍體馬鈴薯葉片中，C系列綠原酸含量最高，其次為151系列，RH系列綠原酸含量最低。

進(jìn)一步采用SPSS16.0對(duì)C系列、151系列和RH系列葉片的綠原酸測(cè)定值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示。 在選取的樣本中，綠原酸含量的平均值、全距、方差數(shù)值、標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值、最大數(shù)值為C系列最大，其次為151系列，RH系列最低。

表1 二倍體馬鈴薯葉片綠原酸含量SPSS統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 1 SPSS statistical analysis results of chlorogenic acid content in diploid potato leaves

由表1和圖4可知，RH系列二倍體馬鈴薯葉片綠原酸含量最低，樣本中最高為5 486.46 mg·kg-1(FW)，其次為151系列，樣本中最高為7 685.41 mg·kg-1(FW)，C系列二倍體馬鈴薯葉片綠原酸含量最高，樣本中最高達(dá)到12 022.25 mg·kg-1(FW)，平均為151系列的1.62倍，RH系列的2.92倍，但其綠原酸含量的均勻性和穩(wěn)定性相對(duì)較低。

選取C系列二倍體馬鈴薯，對(duì)其薯肉和薯皮的綠原酸提取液進(jìn)行吸收光譜分析，結(jié)果如圖5(a,b)所示。

圖5 馬鈴薯薯皮(a)和薯肉(b)綠原酸吸收光譜圖

由圖5(a,b)可知，在波長(zhǎng)為327 nm時(shí)，C系列薯皮的吸收值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于薯肉。 通過(guò)對(duì)C系列二倍體馬鈴薯181個(gè)樣本中薯皮和薯肉的綠原酸含量進(jìn)行光譜測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。

圖6 馬鈴薯薯皮和薯肉綠原酸含量的測(cè)定Fig.6 Determination of chlorogenic acidin potato skin and flesh

比較圖5和圖6，C系列二倍體馬鈴薯薯皮中綠原酸含量明顯高于薯肉，薯肉綠原酸含量整體隨薯皮綠原酸含量的增加而增加，但不呈線性關(guān)系。 薯皮綠原酸含量主要集中于1 000～6 000 mg·kg-1(DW)之間，薯肉中綠原酸含量主要集中于100～400 mg·kg-1(DW)之間(如圖7所示)。

圖7 馬鈴薯綠原酸含量離散圖Fig.7 Discrete figure of chlorogenicacid content in potato

表2 馬鈴薯薯皮和薯肉綠原酸含量SPSS統(tǒng)計(jì)分析結(jié)構(gòu)Table 2 SPSS statistical analysis structure of chlorogenic acid content in potato skin and potato meat

采用SPSS16.0對(duì)C系列薯肉和薯皮綠原酸測(cè)定值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表2所示。 在選取的樣本中，C系列馬鈴薯薯皮綠原酸含量的平均值、全距、方差數(shù)值、標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值、最大數(shù)值均大于薯肉。

結(jié)果表明，C系列馬鈴薯薯皮中綠原酸含量高于薯肉，平均為6.7倍。 薯皮中綠原酸含量最高達(dá)到19 679.59 mg·kg-1(DW)，薯肉中最高為2 927.52 mg·kg-1(DW)，薯肉中綠原酸含量的穩(wěn)定性和均勻性相對(duì)于薯皮較好。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)二倍體馬鈴薯葉片、薯皮和薯肉綠原酸含量的測(cè)定分析，所選取的樣本中C系列馬鈴薯葉片中綠原酸明顯高于151系列和RH系列，平均為151系列的1.62倍，為RH系列的2.92倍，最高達(dá)到12 022.25 mg·kg-1(FW)，但C系列葉片中綠原酸含量的均勻性和穩(wěn)定性低于151系列和RH系列。 C系列馬鈴薯薯皮中綠原酸含量明顯高于薯肉，所選取的樣本中，薯皮綠原酸含量平均為薯肉的6.71倍，薯皮中最高含量達(dá)到19 679.59 mg·kg-1(DW)，薯肉中最高含量為2 927.52 mg·kg-1(DW)，薯皮綠原酸含量主要集中于1 000～6 000 mg·kg-1(DW)之間，薯肉中綠原酸含量主要集中于100～400 mg·kg-1(DW)之間，薯肉中綠原酸含量整體隨著其在薯皮中增高而增高，但不呈線性關(guān)系，薯肉中綠原酸含量更加均勻、穩(wěn)定。