miR-21靶向調(diào)控PDCD4對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

曾 磊，王美燕，付學(xué)峰

0 引言

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(Cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)是我國最常見的皮膚惡性腫瘤之一，起源于表層皮膚或皮膚附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞，多發(fā)于面部、耳部、手背等見光部位[1-2]。cSCC發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是多種因素逐步影響、綜合作用的結(jié)果，暫無有效治療措施。因此,研究cSCC發(fā)病的分子機(jī)制，尋求有效并可靠的靶向治療目標(biāo)，是當(dāng)前cSCC基因治療的熱點(diǎn)[3]。研究表明，與正常皮膚細(xì)胞相比，cSCC細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄水平和模式均存在差異，而細(xì)胞內(nèi)的非編碼RNA在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，存在于多種生物基因組中，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等多種過程[5]。miR-21可看作一種致癌基因，在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展、演變進(jìn)程等，近年研究發(fā)現(xiàn)，在cSCC中同樣存在miR-21的異常表達(dá)[6-7]。程序性細(xì)胞死亡因子4(Programmed cell death 4,PDCD4)是一種抑癌基因，在人腦、肝、肺、胃、皮膚等多種組織中均有表達(dá)，而在結(jié)直腸癌、卵巢癌、胃癌等多種腫瘤組織中則存在PDCD4的低表達(dá)甚至缺失，且與腫瘤的演變進(jìn)程、惡性程度和預(yù)后生存密切相關(guān)[8-9]。在cSCC中PDCD4表達(dá)下降，但其對(duì)cSCC細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為中的影響尚無定論[10]。本研究通過探討miR-21和PDCD4對(duì)cSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的影響，以期為cSCC的診療提供有效的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 人正常皮膚細(xì)胞HaCaT及人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A431、HSC-5、SCL-1 購于上海生命科學(xué)研究所；逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、Trizol試劑盒、蛋白提取試劑盒均購于德國QIAGEN公司；Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑、熒光素酶試劑盒均購于美國vector公司；MTT試劑盒、Transwell試劑盒、Western blot試劑盒購自美國BD公司；miR模擬物(miR-21 mimic)及陰性對(duì)照(miR-NC)、miR抑制劑(miR-21 inhibitor)及陰性對(duì)照(miR-NC)、PDCD4過表達(dá)載體(OE-PDCD4)及陰性對(duì)照(OE-NC)、PDCD4干擾載體(si-PDCD4)及陰性對(duì)照(si-NC)、miR-21和U6引物均購于上海吉瑪有限公司；野生型(WT)和突變型(MUT)PDCD4質(zhì)粒由上海生工生物公司合成；PDCD4抗體及相應(yīng)二抗均購于美國Sigma公司。

1.2 研究方法 細(xì)胞培養(yǎng)：取出凍存在液氮罐中的HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1細(xì)胞株，37 ℃水浴解凍，以DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、95%濕度、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，定期換液。

1.2.1 PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒說明書，以相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min，最后80 ℃ 5 min。采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，95 ℃ 5 min預(yù)變性，然后90 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行，miR-21和U6引物見表1。miR-21的表達(dá)水平采用等式2-△△CT法分析，△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)組-△CT對(duì)照組；△CT實(shí)驗(yàn)組=CT目標(biāo)基因，實(shí)驗(yàn)組-CT內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)組；△CT對(duì)照組=CT目標(biāo)基因，對(duì)照組-CT內(nèi)參基因，對(duì)照組；2-△△CT表示觀察組相對(duì)于對(duì)照組miR-21的表達(dá)倍數(shù)。

表1 miR-21和U6 PCR引物序列

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期A431細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，將細(xì)胞分為空載體對(duì)照組(Control)、miR-21抑制劑組(miR-21 inhibitor)和陰性對(duì)照組(miR-NC)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)80%以上時(shí)，轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine TM 2000操作說明將空載體、miR-21 inhibitor、miR-NC、OE-PDCD4、OE-NC、si-PDCD4、si-NC分別轉(zhuǎn)染至A431、SCL-1細(xì)胞中，37℃、95%濕度、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)PDCD4表達(dá) 收集各組細(xì)胞，按照總蛋白提取試劑盒說明書操作提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量。取蛋白樣品進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗PDCD4(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，暗室顯影，采用Quantity One凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣品重復(fù)3次。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/孔，繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h時(shí)加入20 μl(5 mg/mL)MTT溶液，孵育3 h，棄上清，添加150 μl DMSO。微孔板分光光度計(jì)檢測(cè)490 nm處的吸光度。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/孔，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80～90%融合度時(shí)，用移液槍在細(xì)胞單層中劃出傷口，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察傷口愈合情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前棄去原細(xì)胞培養(yǎng)液，更換成無血清培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化細(xì)胞，取5×105個(gè)細(xì)胞重懸。取40 μl Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室，待膠凝固后，取200～250 μl細(xì)胞懸液至Transwell小室，下層加入500 μl完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，4%甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染液避光染色，清洗晾干后倒置熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在1 500 r/min下離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌。加入5 μl的7AAD和PE標(biāo)記的Annexin V。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 熒光素酶實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建含有PDCD4 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)的pGL3-PDCD4-WT野生型熒光素酶報(bào)告載體和不含PDCD4 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)的pGL3-PDCD4-MUT突變型熒光素酶報(bào)告載體，將pGL3-PDCD4-WT、pGL3-PDCD4-MUT分別與miR-21 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染至A431細(xì)胞中，24 h后檢測(cè)熒光素酶活性，計(jì)算公式：相對(duì)熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

2 結(jié)果

2.1 4種皮膚細(xì)胞中miR-21和PDCD4表達(dá)比較 通過qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-21表達(dá)、Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞PDCD4表達(dá)，其中miR-21以U6為內(nèi)參、PDCD4以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果顯示，與正常皮膚細(xì)胞HaCaT相比，A431、HSC-5、SCL-1細(xì)胞中miR-21表達(dá)均上升，PDCD4表達(dá)均下降，以A431、SCL-1細(xì)胞變化最為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。因此，選擇細(xì)胞株A431、SCL-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 4種皮膚細(xì)胞中miR-21和PDCD4表達(dá)比較注：A.HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1 4種細(xì)胞miR-21表達(dá)比較；B.HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1 4種細(xì)胞PDCD4表達(dá)比較。*與HaCaT相比，P<0.05

2.2 miR-21和PDCD4靶向關(guān)系的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-21與PDCD4存在特異性結(jié)合位點(diǎn)(見圖2)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PDCD4-WT與miR-21 mimics共轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，而PDCD4-MUT與miR-21 mimics共轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性無變化(P>0.05)，說明PDCD4是miR-21的靶基因(見圖3)。

圖2 miR-21與PDCD4結(jié)合位點(diǎn)

圖3 熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-21與PDCD4之間的靶向關(guān)系注：與miR-NC相比，*P<0.05

2.3 轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor后A431細(xì)胞中miR-21和PDCD4表達(dá) 通過qRT-PCR檢測(cè)各組A431和SCL-1細(xì)胞中miR-21表達(dá)、Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞PDCD4表達(dá)，其中miR-21以U6為內(nèi)參、PDCD4以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果顯示，miR-NC、OE-NC與Control組miR-21、PDCD4表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與miR-NC組相比，miR-21 inhibitor組miR-21表達(dá)下降，PDCD4表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與OE-NC組相比，OE-PDCD4組miR-21表達(dá)不變，PDCD4表達(dá)增加(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組A431、SCL-1細(xì)胞中miR-21和PDCD4表達(dá)情況注：A.各組A431細(xì)胞中miR-21表達(dá)情況；B.各組A431細(xì)胞中PDCD4表達(dá)情況；C.各組SCL-1細(xì)胞中miR-21表達(dá)情況；D.各組SCL-1細(xì)胞中PDCD4表達(dá)情況。*與miR-NC組相比，P<0.05；#與OE-NC組相比，P<0.05

2.4 miR-21靶向調(diào)控PDCD4表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A431和SCL-1細(xì)胞中，miR-NC、OE-NC與Control組細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與miR-NC組相比，miR-21 inhibitor組第24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的細(xì)胞活力下降；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與OE-NC組相比，OE-PDCD4組第24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的細(xì)胞活力下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 miR-21靶向調(diào)控PDCD4表達(dá)對(duì)A431、SCL-1細(xì)胞增殖的影響注：A.各組A431細(xì)胞活力比較；B.各組SCL-1細(xì)胞活力比較。*與miR-NC組相比，P<0.05；#與OE-NC組相比，P<0.05

2.5 miR-21靶向調(diào)控PDCD4表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞遷移、侵襲的影響 細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A431和SCL-1細(xì)胞中，miR-NC、OE-NC與Control組傷口愈合百分比、侵襲細(xì)胞數(shù)目比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與miR-NC組相比，miR-21 inhibitor組傷口愈合百分比和侵襲細(xì)胞數(shù)目均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與OE-NC組相比，OE-PDCD4組傷口愈合百分比和侵襲細(xì)胞數(shù)目均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 miR-21靶向調(diào)控PDCD4表達(dá)對(duì)A431、SCL-1細(xì)胞遷移、侵襲的影響注：A.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A431、SCL-1細(xì)胞中miR-21 inhibitor對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響(400×)B.各組細(xì)胞傷口愈合百分比比較；C.Transwell檢測(cè)A431、SCL-1細(xì)胞中miR-21 inhibitor對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響(400×)；D.各組細(xì)胞侵襲數(shù)目比較。*與miR-NC組相比，P<0.05；#與OE-NC組相比，P<0.05

2.6 miR-21靶向調(diào)控PDCD4表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A431和SCL-1細(xì)胞中，miR-NC、OE-NC與Control組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與miR-NC組相比，miR-21 inhibitor組細(xì)胞凋亡率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與OE-NC組相比，OE-PDCD4組細(xì)胞凋亡率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

2.7 干擾PDCD4對(duì)A431、SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 結(jié)果顯示，干擾PDCD4表達(dá)后，A431、SCL-1細(xì)胞中PDCD4表達(dá)下降(圖7A)，24 h、48 h、72 h的OD值均上升，傷口愈合百分比、細(xì)胞侵襲數(shù)目均上升，細(xì)胞凋亡率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖8。

圖7 miR-21靶向調(diào)控PDCD4表達(dá)對(duì)A431、SCL-1細(xì)胞凋亡的影響注：A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A431、SCL-1細(xì)胞中miR-21 inhibitor對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；B.各組細(xì)胞凋亡率比較。*與miR-NC組相比，P<0.05；#與OE-NC組相比，P<0.05

圖8 干擾PDCD4對(duì)A431、SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響注：A.干擾PDCD4表達(dá)后A431、SCL-1細(xì)胞中PDCD4表達(dá)情況；B.干擾PDCD4后A431、SCL-1細(xì)胞增殖變化；C.干擾PDCD4后A431、SCL-1細(xì)胞遷移變化(400×)；D.干擾PDCD4后A431、SCL-1細(xì)胞侵襲變化(400×)；E.干擾PDCD4后A431、SCL-1細(xì)胞凋亡變化。*與si-NC相比，P<0.05

3 討論

cSCC是一種常見的皮膚惡性腫瘤，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和預(yù)后生存，多發(fā)于老年群體，尤以50～60歲老年患者最為常見。cSCC好發(fā)于皮膚暴露部位，早期表現(xiàn)為浸潤(rùn)性斑塊，且具有復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特征，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不清[11-12]。近年來生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，cSCC的發(fā)展是一個(gè)多基因、多因素、多階段影響的過程，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制涉及多種信號(hào)通路[13]。因此，從分子生物學(xué)角度出發(fā)尋找靶向治療cSCC的標(biāo)志物，有望為患者提供一種可靠的治療方法。

miRNA是一種約由18～24個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，可與其靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)特異性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA的降解或抑制其翻譯過程，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的靶向調(diào)控，影響細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等過程[14-15]。目前認(rèn)為，miRNA在機(jī)體中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)和血管新生等過程[16]。miR-21是一種典型的癌基因，可通過JAK/STAT信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路、RaS/MAPK信號(hào)通路及PI3K/AKT信號(hào)通路等多個(gè)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，幾乎在所有上皮源性的惡性實(shí)體腫瘤中都存在miR-21的高表達(dá)[17-18]。抑制或敲除miR-21的表達(dá)能夠抑制肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，對(duì)抗腫瘤治療具有重要意義[19]。在本研究中，miR-21在cSCC細(xì)胞株中均呈高表達(dá)，提示在cSCC中miR-21同樣存在致癌作用。轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor后，A431細(xì)胞在24 h、48 h、72 h時(shí)的增殖能力顯著下降，表明抑制miR-21表達(dá)后可有效抑制A431細(xì)胞的增殖。經(jīng)細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-21表達(dá)后，傷口愈合百分比和細(xì)胞侵襲數(shù)目下降，即細(xì)胞遷移和侵襲能力受到抑制。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A431細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21的表達(dá)能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡能力。表明miR-21有可能作為治療cSCC的有效靶標(biāo)。

PDCD4是一種在進(jìn)化上高度保守的抑癌基因，正常表達(dá)于多種組織和器官中，但在腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)甚至不表達(dá)[20]。在宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，PDCD4能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的惡性行為學(xué)活動(dòng)[21]。對(duì)乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4在其癌組織中低表達(dá)，同時(shí)miR-21呈高表達(dá)，miR-21的過表達(dá)能夠抑制PDCD4，從而參與乳腺癌的發(fā)生[22]。本研究結(jié)果中，各cSCC細(xì)胞中，PDCD4呈低表達(dá)。過表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)A431、SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力顯著下降，而細(xì)胞凋亡率明顯上升。而干擾PDCD4表達(dá)后，A431、SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力顯著上升，而細(xì)胞凋亡率明顯下降。這可能與PDCD4進(jìn)一步調(diào)控其下游信號(hào)通路相關(guān)。此外，通過生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)，miR-21與PDCD4存在特異性結(jié)合位點(diǎn)，而熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明miR-21可靶向負(fù)調(diào)控PDCD4表達(dá)。

綜上所述，cSCC細(xì)胞中均存在miR-21的高表達(dá)和PDCD4的低表達(dá)，且miR-21能夠靶向負(fù)調(diào)控PDCD4表達(dá)，抑制miR-21表達(dá)后，cSCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力均下降，細(xì)胞凋亡率上升，其作用可能與miR-21表達(dá)下降后PDCD4表達(dá)上升有關(guān)。