Napabucasin對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及遷移的影響

徐樹(shù)濤， 彭 銳， 鄒方東

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610065)

1 引 言

結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是一種嚴(yán)重的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害身體健康[1].據(jù)報(bào)道，全球每年約有53萬(wàn)患者死于該疾病[2].目前對(duì)于結(jié)直腸癌的治療仍然是以手術(shù)為主，放化療經(jīng)常被用于結(jié)直腸癌患者的晚期治療，但是仍然有約一半的患者在接受治療后死亡[3].因此需要更有效的方法及藥物來(lái)治療這種疾病.

結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性程度與信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的活性密切相關(guān)[4].STAT3蛋白是一種致癌轉(zhuǎn)錄因子[5]，在乳腺癌[6]、卵巢癌、血液病[7]以及肝癌等多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)度活化.作為轉(zhuǎn)錄因子，STAT3是許多致癌途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，有希望成為治療結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)[8].為了抑制結(jié)直腸癌的遷移、侵襲，以及發(fā)生發(fā)展，使用特異性靶向STAT3的抑制劑可能是一種有效的治療結(jié)直腸癌的方法.

Napabucasin是能夠靶向于STAT3的小分子抑制劑，抑制STAT3驅(qū)動(dòng)的基因轉(zhuǎn)錄[9]. Napabucasin在胃癌[10]、前列腺癌[11]、非小細(xì)胞型肺癌[12]等癌癥中發(fā)揮抑制腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSCs)自我更新的作用，還可誘導(dǎo)這些癌細(xì)胞發(fā)生凋亡.正因?yàn)橐許TAT3為靶點(diǎn)的靶向治療具有光明前景以及Napabucasin在這些腫瘤治療中的良好效果，我們期望通過(guò)研究Napabucasin對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞在增殖以及遷移等方面的影響，來(lái)初步分析靶向STAT3抑制劑的作用機(jī)理及其有效性，以期實(shí)現(xiàn)STAT3抑制劑早日廣泛應(yīng)用于臨床，為結(jié)直腸癌患者的臨床治療提供更多的選項(xiàng).

2 材料與方法

2.1 材 料

人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116，DLD1購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)，人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO則為張林教授(匹茲堡大學(xué))饋贈(zèng)；小分子抑制劑Napabucasin購(gòu)買(mǎi)自Selleck公司(中國(guó)上海藍(lán)木化工有限公司)，CAS號(hào)為：83280-65-3.Wnt agonist 1購(gòu)買(mǎi)自上海陶素生化科技有限公司，其CAS號(hào)為853220-52-7.

2.2 方 法

2.2.1 Napabucasin與STAT3蛋白的模擬對(duì)接 STAT3蛋白結(jié)構(gòu)是通過(guò)swiss-model 網(wǎng)站預(yù)測(cè)而得.小分子抑制劑Napabucasin的3D結(jié)構(gòu)是從pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到. 分子對(duì)接軟件選擇了開(kāi)源軟件Autodock4[13].

2.2.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 用不同濃度的Napabucasin處理對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞，對(duì)照組加入等量的DMSO. 每隔3 d更換新鮮的完全培養(yǎng)基并觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài).7 d之后去除培養(yǎng)液，甲醇固定并用結(jié)晶紫染色，拍照后用imageJ軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞用對(duì)應(yīng)濃度的Napabucasin處理24 h之后(對(duì)照組加入等量的DMSO)，按照劃痕插件每個(gè)小室5×104個(gè)細(xì)胞鋪板，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁之后，拔掉劃痕插件，按時(shí)觀(guān)察并拍照記錄細(xì)胞遷移情況.用ImageJ軟件測(cè)量遷移距離，計(jì)算遷移率.

3.1 Napabucasin抑制STAT3活性的機(jī)制

為了探究Napabucasin與STAT3之間的作用原理，本研究利用Autodock4軟件對(duì)STAT3進(jìn)行了Napabucasin小分子模擬對(duì)接.如圖1A所示，Napabucasin小分子能夠與STAT3蛋白中的第710位的苯丙氨酸之間形成氫鍵，而此位點(diǎn)正好位于STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域之內(nèi)(圖1A)，靠近重要的磷酸化位點(diǎn)Tyr705.所以我們推測(cè)Napabucasin可能是通過(guò)抑制STAT3的磷酸化從而抑制了STAT3蛋白的活性.在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116中，用Napabucasin處理之后，p-STAT3含量明顯降低，而STAT3總蛋白含量沒(méi)有明顯的變化(圖1B)，說(shuō)明Napabucasin處理之后，確實(shí)降低了有活性的磷酸化形式的STAT3含量.

圖1 Napabucasin與STAT3蛋白的Phe710結(jié)合并抑制STAT3磷酸化

3.2 Napabucasin能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的集落形成能力

為了分析STAT3對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響，我們根據(jù)不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系的IC50值，選擇了不同的Napabucasin濃度來(lái)處理相應(yīng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞.如圖2所示，用Napabucasin處理之后，三種結(jié)直腸癌細(xì)胞系的克隆形成能力都明顯受到的抑制(P<0.05).該結(jié)果說(shuō)明Napabucasin處理之后，降低了結(jié)直腸癌細(xì)胞的單細(xì)胞集落形成能力.

圖2 Napabucasin對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響A.Napabucasin處理之后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的克隆形成能力受到了明顯的抑制; B. 結(jié)直腸癌細(xì)胞形成的克隆數(shù)目統(tǒng)計(jì). *P<0.05,**P<0.01，***P<0.001Fig. 2 Napabucasin inhibits proliferation of Colorectal cancer cellsA.After Napabucasin treatment,the colony forming ability of colorectal cancer cells was significantly inhibited; B. the number of colonies formed by colorectal cancer cells. *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3.3 Napabucasin能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力

為了探究Napabucasin對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)分析Napabucasin處理后三種結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移率的變化.結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，用Napabucasin處理后的實(shí)驗(yàn)組遷移率明顯低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組遷移能力明顯減弱，與對(duì)照組相比，具有顯著性差異(P<0.05).本結(jié)果說(shuō)明結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力都受到了Napabucasin的明顯抑制.

3.4 Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)了Napabucasin抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的過(guò)程

Wnt信號(hào)通路與STAT3有很多相同的下游靶基因[14]，為了研究Wnt信號(hào)通路是否參與了Napabucasin抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲等過(guò)程.通過(guò)蛋白免疫印跡檢測(cè)HCT116細(xì)胞在經(jīng)Napabucasin處理之后蛋白含量的變化，發(fā)現(xiàn)p-GSK3β以及β-catenin的含量出現(xiàn)了降低(圖4A).

圖3 Napabucasin能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移A.用Napabucasin處理之后，HCT116細(xì)胞遷移率下降了23%; B. 用Napabucasin處理之后，DLD1細(xì)胞遷移率下降了26%; C. 用Napabucasin處理之后，RKO細(xì)胞遷移率下降了27%. 圖中標(biāo)尺的長(zhǎng)度為200 μm，每個(gè)處理有三個(gè)生物學(xué)重復(fù).** P<0.01， **** P<0.0001.Fig.3 Napabucasin inhibits migration of Colorectal cancer cellsA. After treatment withNapabucasin,the migration rate of HCT116 decreased by 23%; B. after treatment with Napabucasin,the migration rate of DLD1 decreased by 26%; C. after treatment with Napabucasin,the migration rate of RKO decreased by 27%. **P<0.01,****P<0.0001.

為了驗(yàn)證Napabucasin處理是否影響了Wnt信號(hào)通路，我們用Wnt信號(hào)通路的激活劑Wnt agonist 1與Napabucasin共處理HCT116細(xì)胞，并觀(guān)察其增殖能力.如圖4B所示，當(dāng)用Napabucasin 與Wnt agonist 1共處理的HCT116細(xì)胞時(shí)，與單獨(dú)使用Napabucasin相比，其克隆形成數(shù)目顯著增多(P<0.05).說(shuō)明Wnt信號(hào)通路激活劑Wnt agonist 1恢復(fù)了部分由Napabucasin抑制的增殖能力.圖4C對(duì)細(xì)胞遷移能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與之類(lèi)似.這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明了Wnt信號(hào)通路參與了Napabucasin抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移以及侵襲過(guò)程.

圖4 Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)了Napabucasin抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲的過(guò)程A.用Napabucasin處理之后，p-GSK3β以及β-catenin的含量明顯下降; B. 用Wnt agonist 1處理之后，HCT116細(xì)胞的增殖能力得到了部分恢復(fù); C. 用Wnt agonist 1處理之后，HCT116細(xì)胞的遷移能力得到了部分恢復(fù). *P<0.05.Fig.4 Wnt signaling mediated the Napabucasin induced the inhibition of proliferation and migration of colorectal cancer cellsA.After treatment withNapabucasin,the content of p-GSK3β and β-catenin decreased significantly; B. after treatment with Wnt agonist 1,the proliferation ability of HCT116 cells was partially restored; C. after treatment with Wnt agonist 1,the migration ability of HCT116 cells partial recovery. *P<0.05.

作為轉(zhuǎn)錄因子，STAT3在大量實(shí)體瘤中組成型活化[15-17].并且，STAT3的活化能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞活性，使許多與生存和增殖相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào).STAT3可以轉(zhuǎn)導(dǎo)很多致癌信號(hào)通路中的基因表達(dá)，能夠直接調(diào)節(jié)多種致癌基因的表達(dá)[18].因此，STAT3成為治療腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)之一.對(duì)已有的STAT3小分子抑制劑進(jìn)行研究，能夠進(jìn)一步的了解他們的作用機(jī)理，為臨床用藥提供更多的數(shù)據(jù)指導(dǎo).

Napabucasin對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用已有報(bào)道，研究人員用濃度為300 nmol/L，500 nmol/L的Napabucasin分別處理143B與MG63兩種骨肉瘤細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，Napabucasin顯著抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖[19].本研究中也觀(guān)察到了同樣的現(xiàn)象，三種不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116，RKO，DLD1)經(jīng)Napabucasin處理之后，無(wú)論是其克隆形成的數(shù)量還是所形成克隆的平均大小，都明顯減少，說(shuō)明Napabucasin能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖.

STAT3信號(hào)通路與β-catenin所調(diào)控的信號(hào)通路存在著很多共同的下游靶基因[14,20]，并且這些基因都能夠在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[21].在本研究中，通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Napabucasin在抑制了STAT3活性之后，Wnt信號(hào)通路中的β-catenin以及p-GSK3β的含量均出現(xiàn)了下降.而這兩種蛋白均為Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子[22-23].p-GSK3β的含量下降，反映了細(xì)胞內(nèi)GSK3β的活性升高，造成β-catenin磷酸化后被泛素降解系統(tǒng)降解[24].本研究通過(guò)Wnt信號(hào)通路的激活劑Wnt agonist 1激活Wnt信號(hào)通路后發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用Napabucasin相比，HCT116細(xì)胞的增殖能力以及遷移能力都明顯增強(qiáng).證明了在調(diào)控結(jié)直腸癌增殖以及遷移過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路與STAT3信號(hào)通路存在著密切聯(lián)系.而這種聯(lián)系是直接聯(lián)系還是間接作用，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明.

STAT3抑制劑在治療惡性腫瘤的增殖以及遷移等方面有著很好的應(yīng)用潛力.對(duì)STAT3抑制劑的研究，有助于改善當(dāng)前放化療治療效果不佳的現(xiàn)狀.本研究初步探究了STAT3抑制劑對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及與Wnt信號(hào)通路的聯(lián)系等方面的影響，為在個(gè)體水平進(jìn)一步探索控制結(jié)直腸癌腫瘤和轉(zhuǎn)移提供了更多可能.