基于宏轉(zhuǎn)錄組研究蔬菜秸稈發(fā)酵體系細菌群落

丁建莉，魏丹，金梁，李艷，李樵，吳凱

（北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所，北京100097）

我國每年有9.8億t作物秸稈產(chǎn)生，其中有2.3億t是蔬菜秸稈，蔬菜秸稈和其他作物秸稈最大的區(qū)別是含水量較高、易腐爛，快速資源化利用是解決問題的出路，既解決環(huán)境問題，又充分利用資源。廢棄物肥料化技術(shù)已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)廢物資源化利用的重要技術(shù)之一[1]。國內(nèi)大多數(shù)有機肥料產(chǎn)品達到無害化標準需發(fā)酵15～20 d，而優(yōu)質(zhì)有機肥料發(fā)酵一般需要45～60 d。腐質(zhì)化周期長是堆肥技術(shù)主要瓶頸[1]。傳統(tǒng)堆肥工藝周期長、肥效差，因此亟需縮短發(fā)酵周期、提高腐解品質(zhì)。好氧發(fā)酵過程實質(zhì)是大分子有機質(zhì)在微生物作用下分解為小分子并形成腐殖質(zhì)的過程。因此，研究快速好氧發(fā)酵過程中有機物料的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，對研究有機物料快速肥料化具有非常重要的指導意義。

近幾年來關于有機物料肥料化過程中微生物群落變化的報道很多，主要是基于宏基因組學，通過高通量測序技術(shù)更精準、更大通量地解析堆肥生境中群落結(jié)構(gòu)變化。2013 年，F(xiàn)arage 等[2]首次利用高通量測序技術(shù)分析堆肥生境微生物總DNA，獲得3×106條序列，揭示變形菌門的乳酸桿菌在研究樣本中的優(yōu)勢地位，從此拉開對堆肥生境中高效降解菌群及相關功能基因資源的新認識。López-gonzález 等[3]發(fā)現(xiàn)堆肥過程中微生物群落多樣性最高的階段是中期。王秀紅等[4]應用高通量測序技術(shù)，從門水平上解析了玉米條垛式好氧發(fā)酵過程起關鍵作用的細菌菌群。大量報道采用Illumina Miseq 高通量測序研究廢棄物堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性及其功能[5-6]。然而，宏基因組技術(shù)只能檢測樣本中種群的存在性，而宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在研究原位微生物功能、發(fā)掘活性微生物資源方面具有天然的技術(shù)優(yōu)勢。

宏轉(zhuǎn)錄組以研究復雜環(huán)境原位功能微生物總RNA 為研究對象，因此表征的特定微生物處于生理活性狀態(tài)。因此，與宏基因組相比較，宏轉(zhuǎn)錄組具有原位研究的優(yōu)勢[7]。宏轉(zhuǎn)錄組分析采集環(huán)境樣品，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后借助二代測序?qū)DNA 進行測序。近年來宏轉(zhuǎn)錄組學廣泛應用到海洋和土壤等生境研究[8]，但應用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析有機物料好氧發(fā)酵的微生物群落變化的報道鮮見。本研究以蔬菜秸稈快速腐熟樣品為研究對象，借助宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，分析活性微生物群落結(jié)構(gòu)變化，旨在更精準地分析好氧發(fā)酵過程中微生物種群結(jié)構(gòu)變化，為解析發(fā)酵過程中起關鍵作用的微生物菌群、進一步改善發(fā)酵工藝、提高腐殖化效率提供指導依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵原料

收集北京市農(nóng)林科學院院內(nèi)溫室種植的西紅柿秸稈為原料，前期收集的西紅柿秸稈曬到半干狀態(tài)，再收集新鮮的西紅柿秸稈，兩者混合一起粉碎至3～5 cm，干濕西紅柿秸稈混合物含水量72.41%。發(fā)酵用牛糞取自北京昌平區(qū)中國農(nóng)機院生態(tài)農(nóng)業(yè)科技園養(yǎng)牛場，牛糞為半風干狀態(tài)，含水量50.23%。

1.2 發(fā)酵方法

有機廢棄物原料按照一定配比充分混合，C/N 在25～30，含水量控制在55%～60%。借助臥式生物好氧反應設備進行發(fā)酵（哈爾濱華美億豐復合材料有限公司），設備容積6 m3，裝料量4 m3左右。設備參數(shù)設置：溫度低于40 ℃時，每12 h 通風補氧20 min；40～50 ℃時，每8 h 通風補氧20 min；當50～69 ℃時，每6 h通風補氧20 min；當溫度高于69 ℃，持續(xù)通風補氧。參照文獻Zhu 等[9]和Saludes 等[10]把發(fā)酵進程劃分為4個不同時期（升溫期、高溫期、降溫期、腐熟期，在本文中分別縮寫為SW、GW、JW、HS）進行取樣，取樣前轉(zhuǎn)動罐體5 min，從罐體前、中、后3 個位置取樣混合均勻；再次轉(zhuǎn)動5 min 后，再次從3 個位置取樣；如此反復取3 次樣品。每個時期取3 個平行樣品，共12 個樣品。樣品一部分測定理化指標和用于發(fā)芽試驗，另一部分-80 ℃保存，待分子生物學分析。

1.3 檢測指標與方法

按照有機物料與水1∶10 的比例混合，1 h 振蕩并靜止后，檢測pH 值。干燥失重法測定含水量。罐體內(nèi)3個不同部位設有3個溫度計，每隔1 h采集溫度一次。采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定有機質(zhì)，凱氏定氮法測定全氮[11]。速效磷采用鉬銻抗比色法測定[12]。銨態(tài)氮測定使用靛酚藍比色法；硝態(tài)氮測定采用紫外分光光度法[13]。發(fā)芽指數(shù)（Germination index，GI）測定參照宋春麗[11]的方法。

1.4 樣品細菌群落高通量測序和定量PCR分析

使 用PowerSoil?Total RNA Isolation Kit（MoBio）試劑盒，提取樣品總RNA，每個樣品取2 g 用于RNA提取試驗，按試劑盒說明書進行操作。上述樣品轉(zhuǎn)錄組總RNA 反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 作為模板，利用微生物16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)通用引物338F/806R[14-15]（引物序列338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；806R：5′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進 行PCR擴增。PCR反應條件如下：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃60 s，30個循環(huán)；72 ℃7 min。PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 分析確保樣品總RNA 無污染。取RNA 樣品使用試劑1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 樣品送至北京奧維森基因科技有限公司應用Illumina MiSeq平臺測序。

使用SYBR Green 定量PCR 法測定16S rRNA 基因，反應在ABI 7500Real-time PCR（ABI，USA）儀器上進行，具體方法參照文獻[16]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用QIIME軟件對原始序列經(jīng)過去除引物接頭、序列拼接、指控過濾等分析處理之后得到有效數(shù)據(jù)。所有高質(zhì)量序列在97%相似度水平進行分析，得到不同操作分類單位（Operational taxonomic unit，OTU）。參照Greengenes 數(shù)據(jù)庫，對OUT 進行注釋。應用Mothur軟件分析樣品細菌Alpha多樣性指數(shù)。

采用Microsoft Excel 2010 進行數(shù)據(jù)整理，使用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，使用CANOCO 5.0 對理化因子和細菌群落組成進行典范對應分析（CCA）。

圖1 好氧發(fā)酵溫度變化曲線圖Figure 1 Curve of aerobic fermentation temperature change

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時期溫度變化、理化性狀與發(fā)芽指數(shù)分析

好氧發(fā)酵過程中，堆體發(fā)生復雜的生化反應產(chǎn)生自熱效應，溫度升高越快，說明微生物活性越強，有機質(zhì)降解的速度越快。堆溫取決于環(huán)境溫度、堆體初始溫度和微生物活性。升溫期又叫中溫期，嗜溫微生物活躍；本研究工藝條件下，50 h左右進入高溫期，嗜熱微生物主導；溫度升至70 ℃以上時，絕大多數(shù)嗜熱微生物失活，有機物降解緩慢，開始降溫。蔬菜秸稈好氧發(fā)酵不同時期溫度變化曲線見圖1，進罐時物料平均溫度為30 ℃，第1 次取樣溫度在45 ℃左右；溫度到達55 ℃之后至最高溫期間進行第2 次取樣；第3 次取樣是降溫期，溫度在45～50 ℃；溫度降到40 ℃左右，趨于穩(wěn)定后進行第4次取樣。

發(fā)酵體系內(nèi)理化因子隨著發(fā)酵進程的推進發(fā)生了差異性變化（見表1），如有效磷和硝態(tài)氮，除了升溫期較高，其余3 個時期未發(fā)生顯著變化；速效鉀除了降溫期，總體呈現(xiàn)增加趨勢。pH 值是影響微觀環(huán)境微生物活性的重要環(huán)境因素之一，堆肥最適pH 為6.5～8.5；高溫期pH 在7.5～8.5 范圍時，微生物分解能力最強；腐熟時pH 一般呈弱堿性，在8～9 左右。本研究好氧發(fā)酵蔬菜秸稈的升溫期pH 值為6.26，腐熟時pH 為8.58（表1），符合腐熟堆肥的一般要求。pH 基本呈現(xiàn)從低到高的變化趨勢，可能是因為升溫期微生物反應劇烈，產(chǎn)生了大量有機酸，但隨著試驗條件下通氧充分，有機酸揮發(fā)使得pH 值逐漸上升；另外，高溫期之后，可能由于物料中微生物分解半纖維素、纖維素和蛋白質(zhì)等有機物形成了弱堿性物質(zhì)，導致pH 上升。發(fā)芽指數(shù)值能有效表征種子生根對堆肥有機物料的植物毒性物質(zhì)的響應，能夠反映堆肥腐熟程度，也是較為可靠的生物學指標。發(fā)芽指數(shù)（發(fā)酵初期為61.81%）隨著發(fā)酵時間的增加而增加，腐熟階段達到94.11%，說明快速好氧發(fā)酵蔬菜秸稈廢棄物達到了無害化。

表1 不同發(fā)酵時期物料理化因子和發(fā)芽指數(shù)Table 1 Physicochemical factors and GI of organic materials during the different fermentation periods

2.2 不同時期16S rRNA基因豐度變化

蔬菜秸稈快速發(fā)酵不同發(fā)酵時期的有機物料樣品16S rRNA 基因豐度測定結(jié)果如圖2 所示，基因拷貝數(shù)在（2.16～9.88）×1011copies·g-1之間變化，高溫期的基因豐度最高（9.88×1011copies·g-1），升溫期的最低，高溫期比升溫期高出7.72×1011copies·g-1。而降溫期和腐熟期差異不顯著，分別是3.12×1011copies·g-1和3.28×1011copies·g-1。高溫期的基因豐度是升溫期的4.57倍，是降溫期的3.17倍。

2.3 不同時期細菌群落多樣性分析

高通量Illumina MiseqTM測序16S rRNA 基因分析，經(jīng)過片段拼接和質(zhì)控過濾后，獲得蔬菜秸稈發(fā)酵4 個時期樣品的有效序列覆蓋度均達到99%以上（表2），說明本研究的測序深度可用于描述整個蔬菜秸稈廢棄物快速好氧發(fā)酵條件下，處于生理活性狀態(tài)的細菌群落結(jié)構(gòu)變化情況。表2 為基于97%的相似水平分析有效序列的多樣性，不同時期的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)沒有顯著性差異。只有Simpson 指數(shù)不同處理之間存在顯著差異，升溫期Simpson 指數(shù)最低（0.83），即多樣性最高，降溫期（0.87）次之；高溫期（0.92）和腐熟期（0.95）多樣性相對較低。

圖2 不同發(fā)酵時期16S rRNA 基因豐度拷貝數(shù)Figure 2 Copy numbers of 16S rRNA gene during the different fermentation periods detected by real-time PCR

表2 不同發(fā)酵時期微生物多樣性指數(shù)變化分析Table 2 Microbial diversity during the different fermentation periods

2.4 不同時期細菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

在蔬菜秸稈快速好氧發(fā)酵的4 個時期，菌群門類隨著發(fā)酵時間變化逐漸發(fā)生演替變化。在4 個時期，主要優(yōu)勢菌門均是厚壁菌門（Firmicutes），但是相對豐度變化很明顯，升溫期、高溫期、降溫期、腐熟期的相對豐度分別是61.65%、94.37%、95.16%、89.23%。升溫期的放線菌門（Actinobacteria）相對豐度高于變形菌門（Proteobacteria）；但高溫期和降溫期正好相反；而腐熟期的第2 高菌門和第3 高菌門分別是Pro?teobacteria 和擬桿菌門（Bacteroidetes）。軟壁菌門（Tenericutes）雖不是優(yōu)勢菌門，但隨著發(fā)酵進程的推進而發(fā)生了顯著的變化（圖3），從升溫期的0.02%，逐漸升高到0.21%。

整個發(fā)酵期間共檢測到16 個菌門，76 個目，221 個菌屬，挑選4 個不同時期代表性細菌菌屬74個，相對豐度分析如圖4 所示。不同發(fā)酵時期都存在的菌屬45 個，而主要菌屬（至少在3 個時期相對豐度大于0.1% 的）有13 個，主要是海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、喬治菌屬（Georgenia）、高溫雙岐菌屬（Thermobifida），Sinibacillus、嗜鹽菌屬（Halocella）、Vulgatibacter，Caldicoprobacter、芽孢桿菌屬（Bacillus）等。在升溫期優(yōu)勢菌屬是Oceanobacillus和Gracilibacillus，相對豐度均大于18%；在高溫期與降溫期優(yōu)勢菌屬是Oceanobacillus和Sinibacillus，相對豐度均大于7%；而腐熟期Sinibacillus的相對豐度最高（大于30%以上）。升溫期相對豐度較高，且存在其他時期極低或未檢出的菌屬，如Salinimicrobium、Enteractinococcus、Glycomyces、Truepera。Sinibacillus隨著發(fā)酵時間推移發(fā)生顯著差異變化，相對豐度在升溫期、高溫期、降溫期、腐熟期分別是3.45%、7.31%、9.79%、31.89%。Ba?cillus在升溫期僅有0.91%，而在高溫期和降溫期均達4%以上，腐熟期又降到2.43%。Caldicoprobacter在升溫期和高溫期均低于0.8%，而降溫期升高到1.56%，腐熟期降到1.07%。Moheibacter在前3 個時期均低于0.3%，但腐熟期豐度達到1.2%以上，是增幅較大的菌屬。

圖3 不同發(fā)酵時期細菌群落優(yōu)勢菌門及相對豐度Figure 3 Bacterial community composition and relative abundance of dominant phylum during different fermention periods

2.5 不同時期細菌群落與理化因子相關性分析

通過CCA 分析不同時期樣品細菌群落結(jié)構(gòu)與理化因子之間的關系（圖5），發(fā)現(xiàn)高溫期與降溫期的群落結(jié)構(gòu)最相似，升溫期與其他幾個時期的群落結(jié)構(gòu)相距最遠。參與分析的環(huán)境因子合計解釋量為90.0%，說明理化因素顯著影響好氧發(fā)酵過程中細菌的群落結(jié)構(gòu)，Axis 1 和Axis 2 排序軸解釋量分別為57.14%和23.30%。各個因子影響順序：pH＞速效鉀＞有機質(zhì)＞硝態(tài)氮＞總氮＞有效磷＞銨態(tài)氮，其中pH 解釋量為54.0%（P=0.006），速效鉀解釋量為17.9%（P=0.004）。由此可知，發(fā)酵體系中的pH 變化是影響體系內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素，也是影響發(fā)酵速率的關鍵因素之一，在發(fā)酵工藝過程中調(diào)控發(fā)酵體系pH，可能是提高發(fā)酵速率的一個有效途徑。

圖4 不同發(fā)酵時期物料細菌群落主要菌屬組成及相對豐度Figure 4 Bacterial community composition and relative abundance at genus level during different fermentation periods

圖5 不同發(fā)酵時期微生物群落與理化因子的CCA分析Figure 5 CCA analysis between physic-chemical parameters and microorganisms

3 討論

3.1 不同發(fā)酵時期16S rRNA基因豐度變化分析

通過定量PCR 技術(shù)分析16S rRNA 基因豐度，可知不同時期細菌豐度存在顯著差異，高溫期細菌豐度顯著高于其他時期，是升溫期的4.6 倍。研究結(jié)果表明隨著溫度的升高，細菌生長能力增強，在高溫期達到峰值；隨著發(fā)酵進程的推進，部分嗜溫細菌將會死亡，所以降溫期細菌豐度明顯低于高溫期；而降溫期和腐熟期的細菌豐度相對穩(wěn)定。Tang 等[17]借助醌類圖譜法研究牛糞和稻草堆肥時也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后期細菌數(shù)明顯低于高溫期的現(xiàn)象。微生物數(shù)量的變化可以間接地表征堆肥腐熟度，可作為參考指標[18]，本研究發(fā)酵過程中微生物數(shù)量經(jīng)歷了從低到高，再由高降低，最后趨于穩(wěn)定的變化過程，對應的有機物料在微生物作用下，經(jīng)歷了一個快速腐解的變化過程。

3.2 不同發(fā)酵時期細菌群落多樣性分析

與宏基因組相比，宏轉(zhuǎn)錄組具有原位研究的優(yōu)勢[7]，本研究基于宏轉(zhuǎn)錄組分析，挖掘原位活性微生物。細菌多樣性變化的分析結(jié)果表明，Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)不同溫度時期差異性不大，這與滑留帥等[19]在研究牛糞發(fā)酵過程中細菌多樣性分析結(jié)果一致。而Simpson 指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)升溫期的多樣性最高，隨著溫度升高多樣性降低，當高溫期到降溫期時，細菌多樣性再次升高，到腐熟階段多樣性逐漸降低。徐小楠[20]和郭亞萍等[21]研究發(fā)現(xiàn)堆肥不同時期微生物的多樣性總體趨勢是從高到低，腐熟階段的多樣性指數(shù)最低，這與本研究結(jié)果（總體趨勢是高-低-高-最低）基本一致，活性細菌菌群多樣性變化結(jié)果顯示，隨著溫度升高只有耐高溫細菌有活性，所以高溫階段活性細菌多樣性指數(shù)有所下降，宏轉(zhuǎn)錄組分析相對傳統(tǒng)方法研究結(jié)果更有針對性，溫度的變化促使活性細菌菌群多樣性在不斷演變。

3.3 不同發(fā)酵時期細菌群落結(jié)構(gòu)演替分析

不同發(fā)酵時期，有機物料中細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的變化，不同時期的相對豐度最高的菌門均為Firmicutes，但豐度值差異很大，這一發(fā)現(xiàn)與牛糞秸稈堆肥體系中應用高通量測序技術(shù)檢測到升溫期和高溫期最高優(yōu)勢菌門均為Proteobacteria 的結(jié)果不同[22]，這種不同可能是分析手段不同所致，報道是基于DNA 水平分析，而本研究方法基于RNA 水平。此外，F(xiàn)irmicutes 更適合高溫，在快速發(fā)酵體系內(nèi)，代謝活性較強，在纖維素降解過程中發(fā)揮著重要作用[23]。Pro?teobacteria 是各時期優(yōu)勢菌門，但在各時期的地位存在一定差異，這個發(fā)現(xiàn)與王秀紅等[4]研究結(jié)果相同。Bacteroidetes 在4 個階段，經(jīng)歷了升高到減少、再升高的變化，在腐熟階段成為優(yōu)勢菌門。Ma 等[24]報道在豬糞和小麥秸稈堆肥發(fā)酵過程中Firmicutes、Proteo?bacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Tenericutes 和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）6 個優(yōu)勢菌門，在本研究中Gemmatimonadetes 不是優(yōu)勢菌門，可能與發(fā)酵的原料不同有關系，也可能是因為宏基因組檢測到的優(yōu)勢菌門在活性細菌中并非優(yōu)勢菌門。非優(yōu)勢菌門在數(shù)量上也發(fā)生著成倍數(shù)的增減變化，比如Tenericutes的相對豐度在腐熟期是高溫期的10.5倍，說明菌群結(jié)構(gòu)隨著發(fā)酵進程推進發(fā)生著群落演替?；趯偎椒治霭l(fā)現(xiàn)菌屬類別和相對豐度也發(fā)生了顯著差異變化。研究發(fā)現(xiàn)在蔬菜秸稈快速好氧發(fā)酵過程中，Oceanobacillus是優(yōu)勢菌屬，前人研究發(fā)現(xiàn)Oceanoba?cillus具有分泌嗜堿胞外酶和特殊活性脂肪酸的潛力[25]，蔬菜秸稈有機物料腐解過程pH 分析結(jié)果表明，發(fā)酵體系處于Oceanobacillus菌屬適合生長的弱堿性環(huán)境，利于此菌屬發(fā)揮分泌特殊的有機酸和酶類的作用，因此可能加速發(fā)酵進程和提高腐殖化程度，但具體還需要進一步研究驗證。以后可嘗試把此菌屬作為腐熟劑接種到有機物料堆肥體系中。通過對不同發(fā)酵時期的菌群結(jié)構(gòu)分析，為提高發(fā)酵速率和有機物料腐熟品質(zhì)方面的研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

通過對蔬菜秸稈快速好氧發(fā)酵過程中活性細菌菌群豐度、多樣性、結(jié)構(gòu)等進行分析，可知菌群數(shù)量、多樣性、組成和相對豐度均有顯著變化。細菌數(shù)量在高溫期最高，升溫期最低；細菌多樣性除Simpson 指數(shù)外，其余指數(shù)總體差異性不顯著；不同時期豐度最高的菌門均為Firmicutes，但相對豐度差異顯著；不同時期菌屬組成和相對豐度之間有明顯差異，升溫期存在其他時期檢測不到的菌屬；通過CCA 分析可知pH是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子。