SPE-UPLC-MS/MS測(cè)定葡萄酒中的高氯酸鹽

王圣儀 溫昊松 王 飛 楊志偉 齊鵬宇 張進(jìn)杰 張 昂,*

(1 秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北，秦皇島 066004； 2河北省葡萄酒質(zhì)量安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北 秦皇島 066004； 3 葡萄酒檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北，秦皇島 066004)

高氯酸鹽是一種無(wú)機(jī)環(huán)境污染物，能通過(guò)母乳影響發(fā)育中嬰兒神經(jīng)中樞的正常發(fā)育[1]，這是由于ClO4-和Ⅰ-結(jié)構(gòu)類似，可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制甲狀腺對(duì)Ⅰ-的吸收[2]。高氯酸鹽常作為氧化劑被廣泛應(yīng)用于軍工行業(yè)與工業(yè)生產(chǎn)[3]，其在干旱地區(qū)的土壤中檢出濃度遠(yuǎn)高于潮濕地區(qū)，因此高氯酸鹽易富集在干旱地區(qū)的葡萄果實(shí)中，進(jìn)而影響葡萄酒安全[4]。許多國(guó)家對(duì)高氯酸鹽每日的攝入量進(jìn)行了規(guī)定，2014年歐盟食品安全局制定高氯酸鹽的每日耐受攝入量為0.3 μg·kg-1[5]。

目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定高氯酸鹽含量的方法主要包括分光光度法、離子色譜-質(zhì)譜法[6-7]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[8]等，其中針對(duì)水、土壤等基質(zhì)中的檢測(cè)研究較多[9-10]，而對(duì)葡萄酒研究較少。Houssain等[11]首次利用離子色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)分析葡萄酒中高氯酸鹽含量；李柚等[12]利用離子色譜技術(shù)建立了測(cè)定紅葡萄酒中高氯酸鹽的分析方法，但上述方法靈敏度均較低，很難滿足進(jìn)出口食品中的限量檢測(cè)要求，且離子色譜法多適用于基質(zhì)簡(jiǎn)單的樣品，對(duì)于復(fù)雜樣品，易受基質(zhì)干擾而無(wú)法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確檢測(cè)。SN/T 4089-2015[13]建立了高氯酸鹽測(cè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，但該標(biāo)準(zhǔn)適用范圍未包含葡萄酒，且此方法易對(duì)質(zhì)譜儀造成污染[14]。姚清華等[15]在測(cè)定茶葉中高氯酸鹽的研究中采用固相萃取(solid phase extraction，SPE)技術(shù)去除了提取液中的茶葉色素和大分子類干擾物質(zhì)；楊志偉等[16]同樣采用SPE技術(shù)對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行前處理，有效減少了樣品對(duì)儀器的污染。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

21種干紅葡萄酒、干白葡萄酒，購(gòu)自秦皇島海港區(qū)廣緣超市；高氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(NaClO4，純度>98%)、高氯酸鹽18O 標(biāo)準(zhǔn)品(NaCl18O4，純度>97%)，美國(guó)Sigma公司；甲酸、甲醇(色譜純)，中國(guó)迪馬科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nexera 30A超高效液相色譜儀，日本島津公司；SCIEX QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀，美國(guó)Applied Biosystems公司；Vortex Genie2T渦旋混勻器，美國(guó)Scientific Industries公司；Million-Q IQ 7000超純水系統(tǒng)，德國(guó)Millipore公司；C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)、Phenyl-Hexyl色譜柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)、C18固相萃取柱(500 mg·3 mL-1)、WAX固相萃取柱(60 mg·3 mL-1)、親水性聚丙烯濾膜(0.20 μm)、尼龍66濾膜(0.22 μm)及聚醚砜濾膜(0.22 μm)，美國(guó)Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制 分別配制1 mg·mL-1的NaClO4和0.5 mg·mL-1NaCl18O4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃保存?zhèn)溆?，根?jù)試驗(yàn)需要用去離子水逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成適當(dāng)濃度的工作液。

用含0.1%甲酸的甲醇配制葡萄酒樣提取液，其中甲醇∶水=10∶9(v∶v)。

將150 mL乙醇和3 g酒石酸移入1 L容量瓶中，用去離子水定容，得到空白基質(zhì)液。

1.3.2 色譜柱與濾膜的選擇 本試驗(yàn)對(duì)C18和Phenyl-Hexyl 2種色譜柱對(duì)高氯酸鹽的保留效果進(jìn)行比較，選擇保留效果最佳的色譜柱，其中C18色譜柱的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，Phenyl-Hexyl色譜柱的填充物為高純度硅膠。

并對(duì)GHP、尼龍66及聚醚砜3種濾膜進(jìn)行比較，選定對(duì)高氯酸鹽通過(guò)率最高的濾膜，防止雜質(zhì)污染儀器。

1.3.3 樣品預(yù)處理 準(zhǔn)確移取5.0 mL酒樣至25 mL聚乙烯離心管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)工作液渦旋混合2～3 min，待凈化。取待凈化酒樣過(guò)WAX固相萃取柱(提前用6.0 mL甲醇和6.0 mL水活化)，依次用5.0 mL水和5.0 mL甲醇淋洗并抽干，之后用6.0 mL 10%氨水甲醇洗脫，氮?dú)獯蹈珊笥?.0 mL定容液(葡萄酒樣提取液)復(fù)溶，經(jīng)GHP濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

1.3.4 檢測(cè)參數(shù) 色譜條件：色譜柱：Phenyl-Hexyl色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm)；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30℃；流動(dòng)相A：5%甲醇溶液(含1%甲酸)；流動(dòng)相B：1%甲酸甲醇溶液，流速：0.2 mL·min-1；洗脫程序：0～2 min 50% B，2～8 min 80% B，8～10 min 50% B，10～12 min 40% B；閥切換：3 min B，8.5 min A。

質(zhì)譜條件：EI離子源；ESI-電離模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring, MRM)；電噴霧電壓：4 000 V；霧化氣壓力：0.5 MPa；氣簾氣壓力：0.35 MPa；輔助氣壓力：0.7 MPa；輔助氣溫度：550℃；碰撞室出口電壓：13 V；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、保留時(shí)間、去簇電壓和碰撞能量見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Parameters of mass spectra

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SCIEX QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀自帶Analyst 1.5 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)，并使用Excel 2016軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

已知自然界中氯元素存在35Cl與37Cl兩種同位素狀態(tài)[22]，使得NaClO4在質(zhì)譜中出現(xiàn)2種質(zhì)量數(shù)不同的質(zhì)譜圖，在1.3.3條件下高氯酸鈉及其內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的母離子和MS2質(zhì)譜圖。其母離子峰見圖1，質(zhì)荷比為98.8的離子片段為Na35ClO4，質(zhì)荷比為100.8的離子片段為Na37ClO4，再分別優(yōu)化相應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)，得MS2圖(圖2、3)。

圖1 母離子質(zhì)譜圖Fig.1 Proton ion mass spectrum

圖2 高氯酸鹽的MS2質(zhì)譜圖Fig.2 Secondary mass spectrum of perchlorate

圖3 內(nèi)標(biāo)物的MS2質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectrum of internal standard

2.2 色譜條件的選擇

2.3 濾膜的選擇

不同材質(zhì)的濾膜對(duì)高氯酸鹽吸附程度存在差異[25]。由圖6可知，ClO4-在尼龍66濾膜上吸附較強(qiáng)，回收率僅為0.9%，而聚醚砜濾膜的回收率為90%，親水GHP濾膜的回收率為98%。同時(shí)親水GHP濾膜具有無(wú)毒性、耐化學(xué)性能優(yōu)良、強(qiáng)度好等優(yōu)點(diǎn)，因此后續(xù)試驗(yàn)確定選用GHP濾膜。

2.4 前處理方式的選擇

為盡可能消除樣品中干擾物的影響，將基體和干擾化合物分離。本試驗(yàn)選擇C18固相萃取柱[26]和WAX固相萃取柱[27]進(jìn)行樣品前處理并與未過(guò)柱進(jìn)樣比較。

由圖7可知，未過(guò)柱樣品色譜圖峰型較寬，基線高，受基質(zhì)影響大(7-A)；過(guò)C18固相萃取柱與未過(guò)柱相比，基質(zhì)影響小，但無(wú)明顯差別(7-B)；過(guò)WAX固相萃取柱的樣液色譜圖基線低，峰型好，基質(zhì)影響小(7-C)。且與其他方法相比，WAX固相萃取柱在分離干擾物時(shí)可對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行富集，增強(qiáng)對(duì)待測(cè)物的檢出能力，這是由于WAX固相萃取柱的填料為混合型弱陰離子交換吸附劑，對(duì)含強(qiáng)酸基團(tuán)的化合物具有高選擇性和靈敏度[16]。因此選擇WAX固相萃取柱作為前處理的固相萃取柱。

注：A:未過(guò)柱； B: C18固相萃取柱； C:WAX固相萃取柱.Note: A: None. B: C18 solid phase extraction column. C: WAX solid phase extraction column.圖7 不同固相萃取柱條件下的樣品色譜圖Fig.7 Sample chromatograms under different solid phase extraction column

圖4 過(guò)Phenyl-Hexyl色譜柱的樣品色譜圖Fig.4 Sample chromatogram of Phenyl-Hexyl column

圖5 過(guò)C18色譜柱的樣品色譜圖Fig.5 Sample chromatogram of C18 column

圖6 3種不同材質(zhì)濾膜對(duì)高氯酸鹽的回收率Fig.6 Recovery rate of perchlorate by three different filter membranes

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

在上述優(yōu)化條件下，使用空白基質(zhì)液配制濃度為1、2、5、10、20 μg·L-1的NaClO4標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為2.5 μg·L-1的NaCl18O4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液平行10次試驗(yàn)，根據(jù)5個(gè)濃度梯度的空白樣品基線噪音值求平均值，根據(jù)3倍信噪比計(jì)算方法檢出限，10倍信噪比計(jì)算方法定量限，最終得到方法回收率為94.5%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)為0.94%～3.17%(表2、3)。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

表2 方法學(xué)驗(yàn)證Table 2 Methodological Validation

表3 葡萄酒中高氯酸鹽加標(biāo)回收率及RSD (n=10)Table 3 Scaling recovery and RSD of Perchlorate in wine (n=10)

表4 葡萄酒樣品檢測(cè)Table 4 Wine sample testing

品高氯酸鹽含量小于1 μg·L-1，3組樣品高氯酸鹽含量在1～15 μg·L-1之間，1組樣品含量為16.65 μg·L-1， 超過(guò)2009年美國(guó)環(huán)保署(united states environmental protection agency, US EPA)建議的飲用水中15 μg·L-1高氯酸鹽濃度標(biāo)準(zhǔn)[5]。

3 討論

前人進(jìn)行樣品前處理時(shí)對(duì)固相萃取柱的選擇各異[29]，其中使用C18固相萃取柱凈化高氯酸鹽樣品的方法較多[20,28]，但C18柱只能去除提取液中的色素和大分子類干擾物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)WAX柱在分離干擾物時(shí)可對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行富集，增強(qiáng)對(duì)待測(cè)物的檢出能力，與楊志偉等[16]使用HPLC-MS檢測(cè)蜂蜜中高氯酸鹽的結(jié)果相同，這可能是由于WAX柱的填料為混合型弱陰離子交換吸附劑，對(duì)含強(qiáng)酸基團(tuán)的化合物具有高選擇性和靈敏度。而C18柱的填充物是基于鍵合的反相(二甲基十八碳硅烷)和不規(guī)則硅膠(硅膠基)顆粒，這種非極性、未封端的吸附劑提供了與表面硅醇基相關(guān)聯(lián)的額外極性作用，與相應(yīng)封端的吸附劑相比增強(qiáng)了對(duì)堿性化合物的保留，因此WAX柱效果更好。本研究?jī)H對(duì)2種固相萃取柱的效果進(jìn)行了比較，WAX柱是否為最佳凈化柱仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立了測(cè)定葡萄酒中高氯酸鹽的定性定量分析方法，通過(guò)對(duì)質(zhì)譜條件、色譜條件和前處理?xiàng)l件的優(yōu)化考察，最終得到UPLC-MS/MS方法的檢出限為0.15 μg·L-1，定量限為0.5 μg·L-1，加標(biāo)回收率介于94.5%～105%之間。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證和實(shí)際樣品檢測(cè)驗(yàn)證本方法可以滿足葡萄酒中高氯酸鹽的日常監(jiān)測(cè)要求，并應(yīng)用于日常監(jiān)測(cè)工作。