鹽津?yàn)豕请umtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性及其保種效果分析

王榮瓊，孫利民，胡 瑀，滕曉紅，邱立華，苗永旺*

(1. 云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650212；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650201；3. 云南省畜牧總站，云南 昆明 650225)

鹽津?yàn)豕请u(Yanjin black-bone chicken)因主產(chǎn)于云南省昭通市鹽津縣而定名，屬肉蛋兼用型地方雞種，具有適應(yīng)性好、耐粗飼、抗病力強(qiáng)、肉嫩味美，營養(yǎng)和藥用價(jià)值高等優(yōu)良種質(zhì)特性，是寶貴的地方畜禽遺傳資源[1-2]。研究表明，鹽津?yàn)豕请u群體內(nèi)的遺傳變異較大，近交程度弱，遺傳多樣性很豐富，選育潛力較大，屬于未經(jīng)系統(tǒng)選育的地方品種[3-5]。

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)積累的突變比核基因高數(shù)倍，其D-loop 區(qū)的突變速度又較其它區(qū)域高。由于D-loop積累的突變多，因此該區(qū)域DNA序列是進(jìn)行種下水平遺傳多樣性和群體遺傳組成分析的理想遺傳標(biāo)記，效果好、靈敏度高[6]。近年，采用D-loop標(biāo)記，已對家雞及其野生近緣種紅原雞的世系組成及其地理分布進(jìn)行了深入研究[7-9]。本研究利用適合進(jìn)行種下水平遺傳多樣性分析的mtDNA D-loop區(qū)序列為遺傳標(biāo)記，采用 PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)，進(jìn)行群體變異檢測和群體遺傳學(xué)分析，以探討鹽津?yàn)豕请u的群體遺傳變異、遺傳組成的動(dòng)態(tài)變化，為鹽津?yàn)豕请u資源的保種和育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2005年本實(shí)驗(yàn)室在云南省鹽津縣的牛寨、鹽井等保種區(qū)采集了79只鹽津?yàn)豕请u(♂：30，♀：49)的血液樣品(YJ2005)。2018年在云南省鹽津縣鹽津?yàn)豕请u保種場采集60只鹽津?yàn)豕请u的血液樣品，公母各半(YJ2018)。每只雞采靜脈血1 mL，與等量DNA保存液混合后，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，用于實(shí)驗(yàn)室檢測分析。為了與云南其他地方雞進(jìn)行比較，本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的云南其他地方雞11個(gè)群體的647條mtDNA D-loop區(qū)序列用于本研究數(shù)據(jù)分析[10-15]。

1.2 基因組DNA的提取

基因組DNA的提取參照苗永旺等[16]所示方法。然后，使用NanoDrop 2000UV-VIS分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)測定其濃度和純度，稀釋成100 ng/μL。

1.3 PCR擴(kuò)增及序列測定

目的片段擴(kuò)增及測序所需引物相同，參照FUMIHITO等[6](正向引物：5'-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3'；反向引物：5'-ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG-3')，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR體系及操作程序參照LIU等[7]。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，含模板DNA(50～100 ng)1 μL，ddH2O 19.375 μL，10×Buffer 2.5μL(Mg2+濃度15 mM)，dNTP(各2.5 mM)1 μL，正、反向引物(20 μM)各0.5 μL，Taq酶(TaKaRa公司)0.125 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；然后94 ℃ 1 min，63 ℃ 1min，72 ℃ 1 min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸5 min，最后4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳檢測后，進(jìn)行回收純化，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向直接測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所獲序列經(jīng)人工檢查核對后，以.seq格式輸出，利用ClustalX軟件對所得序列進(jìn)行序列比對，然后，采用DnaSP6軟件進(jìn)行群體變異位點(diǎn)、DNA多態(tài)性、基因流(gene flow)和群體間遺傳分化、遺傳距離等的計(jì)算和輸出。用MEGA6軟件估算整個(gè)群體的平均遺傳多樣性，進(jìn)行單倍型輸出和群體單倍型世系組成(群體遺傳組成)分析，并基于云南地方雞群體間的遺傳分化指數(shù)，采用鄰接法(Neighbor-jointing, NJ) 構(gòu)建聚類樹。采用Network 5.0軟件構(gòu)建單倍型Median-joining網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異分析

本研究擴(kuò)增片段長539 bp，為家雞mtDNA D-loop區(qū)第I高變區(qū)序列。去掉兩側(cè)測序質(zhì)量較差的序列后，用于本研究的序列長度為520 bp。在所分析的2005年樣品序列中，堿基T、C、A和G平均含量分別為30.2%、29.8%、27.4%和12.7%；共檢測到40個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，占檢測核苷酸位點(diǎn)總數(shù)的7.69%。序列中未發(fā)現(xiàn)插入/缺失，核苷酸的變異主要為轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換顛換比為10.94。在發(fā)現(xiàn)的40個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，單一信息位點(diǎn)8個(gè)，簡約信息位點(diǎn)32個(gè)，共定義了27種單倍型，其中H19、H02、H03、H13單倍型在群體中分布較多，比例分別為13.92%，11.39%，11.39%和8.86%(圖1)。在所檢測的2018年樣品序列中，堿基T、C、A和G平均含量分別為30.1%、29.9%、27.3%和12.7%；共檢測到24個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，占檢測核苷酸位點(diǎn)總數(shù)的4.62%，其中5個(gè)為單一信息位點(diǎn)，19個(gè)為簡約信息位點(diǎn)。在群體中共檢測到13種單倍型，其中H13、H02、H15單倍型在群體中分布較多，比例分別為28.33%，21.67%和13.33%。

兩個(gè)年度相比，2018年采集樣品中單倍型數(shù)量大幅度減少，2005年采集樣品中的18種單倍型在2018年采集樣品中未檢測到，在2018年樣品所發(fā)現(xiàn)的13種單倍型中，只有9種出現(xiàn)在2005年采集的樣品中，其余4種為新出現(xiàn)的單倍型(包括3種E世系單倍型和1種A世系單倍型)。由表1可見，與已檢測的云南其他地方雞相比，YJ2005群體遺傳多樣性水平較高，YJ2018群體遺傳多樣性水平較低。

2.2 群體遺傳分化

將本研究數(shù)據(jù)與已發(fā)表的11個(gè)云南地方雞數(shù)據(jù)合并，估算出云南地方雞各群體間平均遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.14113，群體間基因流Nm=3.04。

表1 云南12個(gè)地方雞群體的遺傳多樣性Table 1 Genetic Diversity in 12 indigenous chickens in Yunnan

云南地方雞群體間的Fst在0.0000～0.5874之間；蘭坪絨毛雞與其它云南地方雞群體間遺傳分化最大，而武定雞與西疇烏骨雞，華坪烏骨雞與他留烏骨雞、普洱毛腳烏雞，他留烏骨雞與普洱毛腳烏雞間遺傳分化最小。YJ2005與YJ2018之間Fst=0.073，在各群體之間處于中等位置。YJ2018與云南其他地方雞的Fst值在0.02055～0.56494之間，與云龍矮腳雞遺傳分化最小，與蘭坪絨毛雞遺傳分化最大；YJ2005與云南其他地方雞的Fst值在0.0000～0.46732之間，與他留烏骨雞、南澗綠耳烏雞、普洱毛腳烏雞間遺傳分化最小，與蘭坪絨毛雞遺傳分化最大?；谠颇系胤诫u群體間的遺傳分化指數(shù)構(gòu)建的聚類樹見圖2。

2.3 世系組成與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

按照已有的家雞mtDNA母系世系劃分方式[7-8]，將本研究及已發(fā)表的數(shù)據(jù)進(jìn)行世系劃分，結(jié)果見表2。云南地方雞群體的mtDNA母系世系血統(tǒng)含有3～7個(gè)不等。與已檢測的云南其他地方雞相比，鹽津?yàn)豕请u群體世系組成與云南本地其他雞種明顯不同(表2)。其單倍型H01和H02屬于B世系(命名為B01、B02)，單倍型H03～H11屬于A世系(命名為A01～A09)；單倍型H12屬于C世系(命名為C01)；單倍型H13～H17屬于E世系(命名為E01～E05)；H18單倍型屬于F世系(命名為F01)；單倍型H19～H31屬于G世系(命名為G01～G13)(圖1)。YJ2005的27個(gè)單倍型可劃分到A、B、C、E、F和G 6個(gè)世系中。YJ2018的13個(gè)單倍型可劃分到A、B、E和G 4個(gè)母系世系中。

基于本研究鹽津?yàn)豕请umtDNA D-loop所有序列構(gòu)建的單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。在單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中，本文分析的所有個(gè)體均可劃分到A、B、C、E、F和G 6個(gè)母系世系中。網(wǎng)絡(luò)圖遺傳關(guān)系顯示，6個(gè)母系世系之間相距至少6步以上變異，揭示它們之間有較大的遺傳分化。由圖3可見，A世系和G世系呈典型的星形分布；YJ2018缺少C、F世系，其單倍型只分布在A、B、E和G世系中，且在E世系中擁有的單倍型及個(gè)體數(shù)量均較多。

表2 云南地方雞群體的母系世系構(gòu)成比Table 2 Clade composition ratio in 12 Yunnan local chickens

3 討 論

本研究對2005年采集的79只鹽津?yàn)豕请u樣品和2018年采集的60只鹽津?yàn)豕请u樣品分別進(jìn)行了群體變異檢測和群體遺傳學(xué)分析。兩個(gè)年度的樣品相比，在突變?yōu)辄c(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)、單倍型多樣度、核苷酸多樣度和群體內(nèi)遺傳距離等指標(biāo)上，2018年采集的鹽津?yàn)豕请u樣品均顯著降低。一般核苷酸多樣度不受樣本含量的影響，是衡量群體遺傳多樣性的主要指標(biāo)[6]。在云南地方雞群體中，蘭坪絨毛雞遺傳多樣性最低，其次為2018年采集的鹽津?yàn)豕请u樣品。由此，揭示2018年的鹽津?yàn)豕请u保種群內(nèi)遺傳變異比2005年的保種群內(nèi)遺傳變異顯著降低，且低于云南大部分地方雞種[10-15]，揭示該雞保種群遺傳基礎(chǔ)變得狹窄，保種效果不佳。

群體遺傳分化分析顯示，云南地方雞群體間存在不同程度的遺傳分化，其中，蘭坪絨毛雞與云南其他地方雞群體間遺傳分化最大。2005年采集的鹽津?yàn)豕请u樣品和2018年采集的鹽津?yàn)豕请u之間已存在較大遺傳分化。它們之間的遺傳分化已大于云南一些其他地方雞之間的遺傳分化，揭示該雞保種群的遺傳組成已發(fā)生改變。

近年研究顯示，家雞是多個(gè)母系起源的，世界家雞和紅原雞的mtDNA母系世系可劃分為A、B、C、D、E、F、G、H和I等世系，其中，A和B世系在中國、日本和東南亞等地的地方雞中普遍存在，C世系為中國黃淮流域地區(qū)地方雞所特有，F(xiàn)、G和H世系為云南及鄰近地區(qū)地方雞所特有，而E世系在印度和歐洲家雞中出現(xiàn)頻率較高[7-8]。本研究2005年采集的鹽津?yàn)豕请u樣品按照已有的劃分標(biāo)準(zhǔn)可分為A、B、C、E、F和G 6個(gè)母系世系世系，相對應(yīng)的單倍型也分布在網(wǎng)絡(luò)圖的5個(gè)大枝上，G和A世系在2005年采集的樣品中占優(yōu)勢(73.41%)，群體中云南特有世系F和G占44.30%；而2018年采集的鹽津?yàn)豕请u樣品只能劃分到A、B、E和G 4個(gè)母系世系中，且出現(xiàn)了2005年采集的樣品中沒有的3個(gè)E世系單倍型(圖1)，群體中E世系所占比例高達(dá)50%。以上結(jié)果揭示，2018年采集的鹽津?yàn)豕请u樣品在群體遺傳組成上與2005年采集的鹽津?yàn)豕请u樣品已存在較大差異，C和F世系已經(jīng)丟失；2018年采集的樣品中尚存的A、B、E和G 4個(gè)母系世系在群體中所占的比例與2005年采集的樣品也不相同，特別是屬于印度和歐洲家雞中普遍存在的E世系血統(tǒng)由原來的10.13%上升到了50%，E世系有多個(gè)新單倍型滲入。以上揭示鹽津?yàn)豕请u保種群受到了較大比例的歐美商品雞血液滲入的影響。

本研究結(jié)果表明，2018年的鹽津?yàn)豕请u保種群遺傳多樣性顯著降低，群體遺傳組成與2005年相比發(fā)生了較大變化，特別是保種群受到了較大比例的歐美商品雞血液的滲入，提示該雞存在近交和導(dǎo)入外血的過程，保種效果不佳。保種群在保種過程中應(yīng)保持其遺傳基礎(chǔ)和群體遺傳結(jié)構(gòu)保持不變；如果群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化和外來血統(tǒng)滲入，保種就沒有達(dá)到目的。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，鹽津?yàn)豕请u保種群遺傳多樣性水平2018年較2005年明顯降低，遺傳基礎(chǔ)變得狹窄，具有A、B、E和G 4個(gè)母系血統(tǒng)來源，母系血統(tǒng)和變異類型減少，推測存在較大比例的歐美商品雞的血液滲入，揭示該群體保種效果不佳。