ctDNA在可切除結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用

王真,劉燕文

(東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

隨著液體活檢的發(fā)展，循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)在腫瘤的篩查、監(jiān)測復(fù)發(fā)、治療耐藥、預(yù)后等方面具有應(yīng)用價(jià)值。ctDNA由腫瘤細(xì)胞釋放入血并且能保留其表觀遺傳學(xué)特征。結(jié)直腸癌最易發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位是肝臟[1]，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移切除與不切除生存率差異較大，但目前對于是否應(yīng)該切除暫無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。作者擬就ctDNA在可切除結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中應(yīng)用的研究進(jìn)展作一綜述。

1 可切除結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移介紹

部分結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者初始狀態(tài)或經(jīng)過轉(zhuǎn)化治療后，可以評估為可切除。根據(jù)2019年CSCO指南，目前鏡下病理無殘余(R0)切除仍是最重要的治療手段，不可切除的則行姑息治療。手術(shù)切除及不可切除的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的5年生存率分別為42%和9%，10年生存率為25%和4%[2]，可見對于可切除患者應(yīng)實(shí)行以手術(shù)為核心的綜合治療模式。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移術(shù)前評估標(biāo)準(zhǔn)包括兩個(gè)維度：(1) 外科技術(shù)維度，足夠的殘留肝臟體積，手術(shù)切緣達(dá)到R0要求[2]；(2) 腫瘤生物學(xué)維度，從復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評分(CRS)、腫瘤病理信息、免疫組化、左右半結(jié)腸、化療敏感性等方面評估。但仍有部分患者R0切除術(shù)后出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)，無病生存期(DFS)較短。同時(shí)手術(shù)切除及術(shù)后恢復(fù)都是對機(jī)體機(jī)能的消耗，將會(huì)影響患者后續(xù)生存質(zhì)量及治療耐受性。因此，需要更多術(shù)前評估指標(biāo)，篩選手術(shù)優(yōu)勢人群，避免不必要的肝切除手術(shù)。

術(shù)后通過評估樣本的邊緣來確定手術(shù)切除結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的根治性。外科手段的R0切除是達(dá)到無疾病狀態(tài)(NED)的手段之一，但是對于微小病灶評估仍存在不足。精準(zhǔn)評估術(shù)后的NED是目前的一個(gè)難點(diǎn)。術(shù)后監(jiān)測手段主要為體檢、腫瘤血清標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)檢測及胸腹盆的增強(qiáng)CT。但是目前血清腫瘤標(biāo)志物存在敏感性較低的缺點(diǎn)；影像學(xué)檢查存在滯后性，也容易漏掃微小病灶。因此急切需要更多的評價(jià)指標(biāo)幫助篩選手術(shù)患者以及進(jìn)行術(shù)后評估監(jiān)測，彌補(bǔ)現(xiàn)有監(jiān)測手段的不足。液體活檢具有無創(chuàng)性、敏感性和動(dòng)態(tài)性等優(yōu)勢，有解決部分現(xiàn)存問題的潛力。其中ctDNA尤其值得關(guān)注，也是液體活檢目前的研究熱點(diǎn)。有多個(gè)研究表明ctDNA在結(jié)直腸癌早期診斷、監(jiān)測術(shù)后早期復(fù)發(fā)、監(jiān)測治療反應(yīng)、治療耐藥、提供預(yù)后信息等方面具有應(yīng)用價(jià)值[3]。ctDNA能否在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中成為一個(gè)可靠的預(yù)測指標(biāo)值得關(guān)注。

2 ctDNA簡介

ctDNA占循環(huán)無細(xì)胞DNA(cfDNA)總量的一小部分，是腫瘤細(xì)胞釋放到血流中的150～200個(gè)堿基對片段，保留了表觀遺傳特征，并攜帶可在外周血中檢測到的腫瘤特異性突變[4]。ctDNA半衰期短，通常小于1 h，可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測腫瘤的變化[5]。ctDNA可來源于腫瘤原發(fā)組織、轉(zhuǎn)移灶和循環(huán)腫瘤細(xì)胞。目前ctDNA主要的監(jiān)測方法有靶向監(jiān)測和非靶向監(jiān)測。靶向監(jiān)測如ddPCR，可以檢測同一樣本的多個(gè)突變，靈敏度高(0.05%～0.001%)，但其多路復(fù)用能力僅限于檢測5～10個(gè)不同的目標(biāo)序列[6]。非靶向監(jiān)測如下一代測序(NGS)，傳統(tǒng)的NGS的靈敏度為2%～5%，通過大規(guī)模并行測序可以同時(shí)檢測數(shù)百種分子異常，優(yōu)化的NGS敏感度已提高[6]。ctDNA的敏感性要遠(yuǎn)高于CEA，并能比影像資料更早預(yù)測治療反應(yīng)及疾病復(fù)發(fā)。Young等[7]提出甲基化的ctDNA敏感性是CEA的2倍，在一項(xiàng)薈萃研究[8]中，ctDNA中Septin9敏感性遠(yuǎn)超血清腫瘤標(biāo)志物，特異性無明顯差異。目前ctDNA部分應(yīng)用已進(jìn)入市場階段。ctDNA可以指導(dǎo)晚期腫瘤患者的藥物選擇，如檢查非小細(xì)胞肺癌T790m突變、指導(dǎo)靶向用藥。Septin9基因甲基化可應(yīng)用于結(jié)直腸癌的早期篩選中。

3 液體活檢ctDNA與組織活檢的一致性

組織活檢提示RAS和BRAF野生型的晚期結(jié)直腸癌患者Ⅰ級(jí)推薦化療加抗表皮生長因子受體(EGFR)治療[2]。RAS、BRAF基因有助于監(jiān)測耐藥、提供用藥指導(dǎo)，同時(shí)它們也有預(yù)測預(yù)后的作用[9]。因此動(dòng)態(tài)監(jiān)測基因變化尤為重要，但組織活檢創(chuàng)傷大且較難多次獲得，而外周血ctDNA容易獲得。液體活檢與組織活檢相關(guān)性的評估很有必要。

Thierry等[10]對106例結(jié)直腸癌患者使用金標(biāo)準(zhǔn)組織活檢及定量PCR監(jiān)測外周血ctDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRAF V600E突變的特異性和敏感性均為100%，KRAS突變特異性為98%，敏感性為92%，一致性值為96%。Bachet等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與腫瘤組織中的RAS狀態(tài)相比，僅使用NGS的準(zhǔn)確率為83%，使用NGS加甲基化生物標(biāo)志物分析的準(zhǔn)確率為93%。在肝轉(zhuǎn)移患者中，兩種檢查聯(lián)合使用的準(zhǔn)確率達(dá)到96%。目前，多個(gè)研究顯示ctDNA檢測到的突變與組織活檢突變的一致性較高[12- 13]。2019年在一項(xiàng)對結(jié)直腸癌KRAS突變與組織一致性的薈萃分析中合并的敏感性、特異性分別為63.7%、94.3%，外周血KRAS突變在特異性方面具有足夠的診斷效能[14]。

在一項(xiàng)關(guān)于肝周血液和外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，肝周血液中CTC水平高與較短的DFS和較短的總生存期(OS)相關(guān)，而外周血CTC并不能預(yù)測預(yù)后。作者考慮外周血和肝周血液CTC的生物學(xué)可能存在差異[15]。Narayan等[16]進(jìn)行了一項(xiàng)關(guān)于組織活檢、外周血ctDNA以及肝周血液ctDNA的臨床研究，檢測TP53、APC突變，提出外周血可以反映肝周ctDNA的信號(hào)，與組織活檢一致性高。

ctDNA與組織活檢的一致性較高，為液體活檢代替組織活檢提供了可能，可以通過對外周血ctDNA定量或者定性的分析，達(dá)到指導(dǎo)用藥和提供預(yù)后信息的目標(biāo)。

4 外周血ctDNA在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用

4.1 外周血ctDNA對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移手術(shù)優(yōu)勢人群的篩選

目前術(shù)前評估的因素有手術(shù)技術(shù)、CRS等方面，但是部分結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后很快出現(xiàn)復(fù)發(fā)，生存獲益低，此類評價(jià)體系可能對他們并不適用。Kemeny等[17]提出陽性的手術(shù)切除邊緣(R1)沒有發(fā)現(xiàn)對無復(fù)發(fā)生存期(RFS)有預(yù)測作用，但是組織中監(jiān)測到KRAS突變的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的RFS降低。Margonis等[18]也得到類似結(jié)論，肝臟切除后存活率的差異是由于KRAS為野生型或突變型，而不是R0或R1切除。這強(qiáng)調(diào)了固有的癌癥生物學(xué)特征的作用，而不是切除邊緣。傳統(tǒng)的評估方式存在爭議，需要反映腫瘤特異性的新的生物標(biāo)志物。同時(shí)組織活檢KRAS突變與外周血ctDNA的一致性較高。此外，He等[19]發(fā)現(xiàn)術(shù)前ctDNA水平與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的腫瘤負(fù)荷顯著相關(guān)，對復(fù)發(fā)有預(yù)測作用。Bhangu等[20]提出ctDNA甲基化的Septin9和AIT 47與腫瘤體積相關(guān)，Septin9能夠區(qū)分最終接受手術(shù)的患者。Lang等[21]也提出可以將RAS通路突變擴(kuò)展到CRS中。在臨床上術(shù)前ctDNA的檢測可以成為參考因素，彌補(bǔ)傳統(tǒng)評估方法的不足。

Bidard等[13]收集了潛在可切除肝轉(zhuǎn)移患者治療前、系統(tǒng)治療1個(gè)月及肝手術(shù)前的外周血標(biāo)本，ctDNA的評估局限于監(jiān)測到KRAS2外顯子突變的患者。基線時(shí)監(jiān)測到ctDNA的患者，R0/R1的切除率較低；經(jīng)過4周的全身治療，ctDNA仍然可監(jiān)測到的患者的R0/R1切除率低于未檢測到的患者(36%vs85%)；術(shù)前監(jiān)測到ctDNA的患者生存期較短。這表明該生物標(biāo)志物可以幫助決定肝臟手術(shù)是否適合患者。

術(shù)前ctDNA陽性患者與陰性者相比，根治率低、生存獲益較少，對后續(xù)化療耐受也有不良影響。對此類患者需要謹(jǐn)慎選擇手術(shù)，以便于患者獲得最佳的治療結(jié)局。

4.2 外周血ctDNA對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移瘤切除術(shù)后NED的評估

外科根治性即R0切除包括病變組織的完整切除，根治性手術(shù)是潛在達(dá)到NED的手段，能夠有效提高患者5年生存率。術(shù)后ctDNA水平有望成為評估NED的新指標(biāo)。Reinert等[22]發(fā)現(xiàn)1例患者術(shù)后外周血監(jiān)測出ctDNA陽性，考慮手術(shù)并非根治性。Norcic等[23]提出對結(jié)直腸癌患者外周血中體細(xì)胞KRAS和BRAF突變的隨訪可能有助于評估疾病的手術(shù)清除。多個(gè)臨床研究[24- 25]表明，ctDNA可以監(jiān)測到術(shù)后的微小殘余病灶。

Benesova等[26]在一項(xiàng)對47例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，28例R0切除患者術(shù)后ctDNA檢測陰性26例(26/28,93%)。陽性患者中1例出現(xiàn)肝臟小轉(zhuǎn)移，射頻消融后患者繼續(xù)顯示ctDNA陽性，隨后在術(shù)后6個(gè)月被診斷為疾病復(fù)發(fā)。另1例患者是根治術(shù)后6個(gè)月通過影像學(xué)方法觀察到復(fù)發(fā)。這意味著ctDNA可以更加敏感地評估術(shù)后NED。Murray等[27]也發(fā)現(xiàn)術(shù)后血中ctDNA甲基化陽性的結(jié)直腸癌患者術(shù)后殘余病灶及復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加。

NED是個(gè)動(dòng)態(tài)的概念，隨著液體活檢等新技術(shù)的發(fā)展，對NED的評估會(huì)越來越準(zhǔn)確。術(shù)后ctDNA陽性提示根治術(shù)后仍可能存在微小殘留病灶。結(jié)合術(shù)后ctDNA水平可以更合理地選擇術(shù)后輔助治療的強(qiáng)度和時(shí)長以及制定術(shù)后隨訪的頻率，推動(dòng)個(gè)性化精準(zhǔn)治療的發(fā)展。

4.3 外周血ctDNA對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移術(shù)后隨訪的評估

根據(jù)CSCO指南，對于Ⅳ期轉(zhuǎn)移瘤R0切除，Ⅰ級(jí)推薦隨訪/監(jiān)測頻率：前3年每3個(gè)月1次，然后6個(gè)月1次至5年,5年后1年1次。隨訪的內(nèi)容包括體格檢查、腫瘤指標(biāo)CEA檢查、每6～12個(gè)月的胸腹增強(qiáng)CT、盆腔增強(qiáng)核磁[2]。如前所述，CEA敏感性較低，影像學(xué)檢查存在滯后性，ctDNA在術(shù)后監(jiān)測中可以為早期發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供依據(jù)。

在早期結(jié)直腸癌根治術(shù)后監(jiān)測中，有研究表明ctDNA陽性者的復(fù)發(fā)率是陰性者的40倍，比影像早16.5個(gè)月預(yù)測復(fù)發(fā)[25]，另一項(xiàng)臨床研究觀察到ctDNA監(jiān)測到復(fù)發(fā)平均先于放射學(xué)和臨床證據(jù)3個(gè)月[28]。在一項(xiàng)230例早期結(jié)直腸癌標(biāo)志物的前瞻性研究中，中位隨訪27個(gè)月，術(shù)后ctDNA陽性患者復(fù)發(fā)率為79%，ctDNA陰性患者復(fù)發(fā)率僅為9.8%[29]。術(shù)后ctDNA在Ⅱ期結(jié)直腸癌中提供殘留疾病的直接證據(jù)，確定復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)極高的患者，在Ⅲ期結(jié)直腸癌中有望成為RFS的預(yù)后因素[30]。

Scholer等[31]提出與CT成像相比ctDNA平均提前9.4個(gè)月檢測到復(fù)發(fā)，23例肝轉(zhuǎn)移患者中術(shù)后3個(gè)月ctDNA陽性者復(fù)發(fā)率為100%，陰性者復(fù)發(fā)率為50%，術(shù)后3個(gè)月的ctDNA監(jiān)測是非常強(qiáng)的預(yù)測復(fù)發(fā)因素。Benesova等[26]監(jiān)測47例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移術(shù)后患者，共22例出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其中13例患者ctDNA、影像學(xué)及腫瘤標(biāo)志物同時(shí)監(jiān)測到復(fù)發(fā)。腫瘤標(biāo)志物7次(32%)陰性，影像學(xué)檢查無腫瘤6次(27%)，ctDNA全部檢測到復(fù)發(fā)，其敏感性最高。4例患者(4/22,18%)僅用ctDNA檢測腫瘤復(fù)發(fā)，影像學(xué)方法及腫瘤標(biāo)志物均為陰性。

術(shù)后的動(dòng)態(tài)監(jiān)測可以提示預(yù)后信息，有助于更早監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)，為盡早實(shí)現(xiàn)臨床干預(yù)創(chuàng)造條件。

4.4 外周血ctDNA在晚期結(jié)直腸癌的治療評估及靶向藥物“再挑戰(zhàn)”中的應(yīng)用

RAS基因野生型的晚期結(jié)直腸癌患者可以從抗EGFR治療中獲益。有趣的是組織中監(jiān)測到RAS突變，但血漿中未監(jiān)測到，依舊可以從抗EGFR治療中獲得生存益處[32]。但是治療數(shù)月可發(fā)生耐藥性，耐藥性的產(chǎn)生與RAS通路突變的出現(xiàn)相關(guān)[33]。血漿ctDNA可以在影像進(jìn)展發(fā)生前更早地監(jiān)測到突變的存在[6]。由于RAS突變導(dǎo)致抗EGFR治療病情進(jìn)展的患者，可能在脫離抗EGFR治療后重新獲得敏感性。在一項(xiàng)抗EGFR“再挑戰(zhàn)”治療的臨床研究中，患者緩解率為53.8%，中位無進(jìn)展生存期為6.6個(gè)月[34]。Cremolini等[35]基于臨床回顧性研究提出西妥昔單抗和伊立替康的再挑戰(zhàn)策略可能對RAS和BRAF野生型晚期結(jié)直腸癌患者有效。組織二次活檢創(chuàng)傷較大，通過分析血漿ctDNA中RAS突變可以選擇適合“再挑戰(zhàn)”的患者[36]。此外，血漿ctDNA早期的濃度變化可以預(yù)測一線或二線的化療療效[37]。

5 總結(jié)與展望

在晚期結(jié)直腸癌中外周血ctDNA與組織活檢一致性較高，為液體活檢提供了理論基礎(chǔ)。目前關(guān)于術(shù)前ctDNA在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移手術(shù)中篩選優(yōu)勢人群的研究較少，文獻(xiàn)局限于個(gè)例或KRAS突變的患者，術(shù)前ctDNA水平高與手術(shù)根治率低、生存期較短相關(guān)。目前也有研究表明，R0、R1切除對于預(yù)后可能無明顯影響，反而是組織或者外周血中RAS突變影響預(yù)后。后續(xù)可以擴(kuò)大樣本的數(shù)量，篩選合適的評價(jià)指標(biāo)。在術(shù)后監(jiān)測和隨訪中，ctDNA陽性提示根治術(shù)后也可能存在殘留病灶，存在快速復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。術(shù)后隨訪監(jiān)測ctDNA 也可以較現(xiàn)有檢查方法更早、更敏感地提示復(fù)發(fā)。ctDNA有望在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移治療中提供全程動(dòng)態(tài)縱向的評估，實(shí)現(xiàn)腫瘤的個(gè)體化精準(zhǔn)治療，讓患者獲得更多的生存效益。

目前ctDNA的分離、檢測還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，陽性的定義各個(gè)實(shí)驗(yàn)室存在差異。需要開展更多、范圍更大的臨床實(shí)驗(yàn)，制定統(tǒng)一的臨床標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)ctDNA在血漿中含量低，在cfDNA占比僅0.2%左右，富集困難，檢測費(fèi)用較高，臨床推廣難度較大。有研究表明，在癌癥患者中長cfDNA片段的濃度比例較高[37]，Iwai等[38]發(fā)現(xiàn)，長鏈cfDNA/β-球蛋白值升高在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移術(shù)后可以提示微小殘留病灶，預(yù)測早期復(fù)發(fā)。在臨床上部分ctDNA監(jiān)測可以考慮由cfDNA代替，減少成本和處理時(shí)間，更容易推廣。ctDNA價(jià)值的確定需要更大規(guī)模的研究和標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的流程，液體活檢在腫瘤診療全過程擁有一個(gè)廣闊的應(yīng)用前景。