快速病原體檢測(cè)技術(shù)在甲型流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

付曉蕊， 康蓓佩， 徐修禮， 趙 峰， 張鵬亮， 周 磊

（1. 空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710032；2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 710032）

急性呼吸道感染（acute respiratory infection，ARI）是社區(qū)和醫(yī)院感染的主要感染之一。甲型流感病毒（influenza A virus，F(xiàn)luA）感染率高，影響范圍廣，已引起臨床的高度關(guān)注。病毒感染可以通過(guò)傳統(tǒng)的方法來(lái)檢測(cè)，如培養(yǎng)或檢測(cè)病毒的特異性抗原，也可以通過(guò)免疫色譜法或分子核酸檢測(cè)等方法快速檢測(cè)[1]。如何選擇敏感性高、特異性強(qiáng)的FluA檢測(cè)方法，更好地為臨床提供快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)依據(jù)，是臨床實(shí)驗(yàn)室的重要任務(wù)。本研究通過(guò)分析FluA特異性抗原和核酸的檢測(cè)結(jié)果，探討快速病原體檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

收集2016年10月—2019年1月空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽的疑似FluA感染患者鼻咽拭子樣本，其中FluA抗原篩查樣本14 179例，F(xiàn)luA核酸檢測(cè)樣本3 697例。另收集同期臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽的疑似呼吸系統(tǒng)感染患者鼻咽拭子樣本312例、支氣管肺泡灌洗液樣本3例，采用FilmArray快速呼吸道病原體檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)常見(jiàn)呼吸道感染相關(guān)病原體，并對(duì)所有患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有患者均知情同意。

鼻咽拭子及支氣管肺泡灌洗液樣本采集后，放入轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中，室溫放置不超過(guò)4 h，（2 ～8）℃不超過(guò)3 d，≤-15 ℃不超過(guò)30 d，樣本避免反復(fù)凍融。

1.2 方法

1.2.1 FluA抗原檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)樣本中的特異性FluA抗原，試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰股份有限公司。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2 FluA核酸檢測(cè) 采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-熒光探針?lè)z測(cè)FluA核酸，試劑盒購(gòu)自達(dá)安基因股份有限公司。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 Film Array快速呼吸道病原體檢測(cè) FilmArray快速呼吸道病原體檢測(cè)試劑盒及全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司，可同步對(duì)多種呼吸道病原體的核酸進(jìn)行擴(kuò)增與檢測(cè)。嚴(yán)格按照儀器和試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FluA抗原與核酸檢測(cè)結(jié)果

14 179例FluA抗原篩查樣本中，陽(yáng)性1 355例，抗原篩查陽(yáng)性率為9.56%；3 697例FluA核酸檢測(cè)樣本中，陽(yáng)性1 009例，核酸檢測(cè)陽(yáng)性率為27.29%。見(jiàn)表1。

表1 FluA核酸及抗原檢測(cè)結(jié)果比較 例

2.2 FluA感染的時(shí)間分布

FluA抗原檢測(cè)的平均陽(yáng)性率為9.56%，F(xiàn)luA核酸檢測(cè)的平均陽(yáng)性率為27.29%；暴發(fā)季（12月—次年2月）FluA抗原檢測(cè)陽(yáng)性率為10.95%，F(xiàn)luA核酸檢測(cè)陽(yáng)性率為27.71%。見(jiàn)圖1。

圖1 2016年10月—2019年1月FluA時(shí)間分布

2.3 FluA感染年齡分布

＜5歲的嬰幼兒、約20歲的青少年以及＞90歲的老年人為易感人群，篩查的陽(yáng)性率較高。見(jiàn)表2。

表2 FluA核酸檢測(cè)陽(yáng)性患者年齡分布

2.4 FluA感染性別分布

2 075例男性患者FluA核酸檢測(cè)陽(yáng)性573例，陽(yáng)性率為27.61%；1 622例女性患者FluA核酸檢測(cè)陽(yáng)性436例，陽(yáng)性率為26.88%。男性與女性比較，F(xiàn)luA核酸檢測(cè)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.227，P＞0.05）。

2.5 FilmArray快速呼吸道病原體FluA檢測(cè)結(jié)果

采用FilmArray快速呼吸道病原體檢測(cè)技術(shù)對(duì)312例發(fā)熱、咳嗽的疑似呼吸系統(tǒng)感染患者進(jìn)行常見(jiàn)呼吸道感染相關(guān)病原體檢測(cè)，陽(yáng)性170例，陽(yáng)性結(jié)果207個(gè)，部分樣本檢測(cè)結(jié)果包括多項(xiàng)陽(yáng)性結(jié)果，見(jiàn)表3。有2例暫未判斷出型別的FluA核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣本（圖2），因反應(yīng)測(cè)試條中引物的局限性不能判定出型別，送西安市疾病預(yù)防控制中心檢測(cè)，回報(bào)結(jié)果為H5N1型流感病毒。

表3 FilmArray快速呼吸道病原體檢測(cè)結(jié)果

圖2 2株未判斷出型別的FluA實(shí)時(shí)PCR溶解曲線

3 討 論

FluA可通過(guò)空氣或飛沫傳播，所致甲型流感為急性呼吸道傳染性疾病[2]。甲型流感能夠在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)聚集性暴發(fā)，潛伏期為1～7 d，早期癥狀與普通感冒相似，在臨床上主要表現(xiàn)為全身酸痛、咳嗽、咽痛、高熱困倦等[3-4]，病情嚴(yán)重時(shí)還會(huì)出現(xiàn)肌肉酸痛、腹瀉等癥狀。甲型流感起病較急、全身癥狀較輕，但病情嚴(yán)重者可以出現(xiàn)肺炎、呼吸衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥[5]，切斷早期傳播途徑和傳染源能夠有效地控制疫情的蔓延[6]。流感病毒有甲、乙、丙和丁4型，目前感染人的主要是FluA中的H1N1、H3N2亞型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系。近2年西安地區(qū)最主要的FluA型別為H1N1型和H3N2型[7-9]。

FluA抗原檢測(cè)屬于定性檢測(cè)，僅進(jìn)行FluA核蛋白抗原檢測(cè)，由于免疫學(xué)檢驗(yàn)存在一定的局限性，抗原篩查并不能確定感染時(shí)間和感染階段，故而應(yīng)配合FluA核酸檢測(cè)。而單獨(dú)的FluA核酸檢測(cè)也存在感染時(shí)間、感染階段、核酸拷貝數(shù)低可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果等問(wèn)題。此外，由于流感病毒待測(cè)靶序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖円矔?huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。對(duì)于突變的新型FluA，在其檢測(cè)的最適樣本類型及感染后的最佳采樣時(shí)間尚不明確時(shí)，均會(huì)對(duì)FluA核酸檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，需要通過(guò)分次、多部位采集樣本來(lái)降低假陰性結(jié)果產(chǎn)生的可能性。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)luA抗原檢測(cè)陽(yáng)性率為9.56%，F(xiàn)luA核酸檢測(cè)陽(yáng)性率為27.29%；暴發(fā)季（12月—次年2月）FluA抗原檢測(cè)陽(yáng)性率為10.95%，F(xiàn)luA核酸檢測(cè)陽(yáng)性率為27.71%。本研究發(fā)現(xiàn)，＜5歲的嬰幼兒、20歲左右的青少年以及＞90歲的老年人為易感人群，篩查的陽(yáng)性率較高。與文獻(xiàn)報(bào)道的年齡＜5歲、＞65歲為高危人群，新生兒早期感染出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀是正常人的3倍的結(jié)果[10]一致。嬰幼兒和老年人由于身體素質(zhì)較差，抵抗力不足，容易出現(xiàn)相應(yīng)的感染，且感染后病情嚴(yán)重、死亡的風(fēng)險(xiǎn)較高[11-12]；20歲左右的青少年多為學(xué)生和上班族，出現(xiàn)交叉感染的概率比較大，建議其預(yù)防性接種疫苗[7]。本研究結(jié)果顯示，近3年疑似FluA感染與性別無(wú)關(guān)。

FilmArray快速呼吸道病原體檢測(cè)技術(shù)采用巢式多重PCR技術(shù)，是集樣本制備、擴(kuò)增、檢測(cè)和分析功能為一體的快速病原體檢測(cè)方法，可以同步檢測(cè)17種呼吸道病毒和3種細(xì)菌，僅需5 min的人工樣本處理和65 min的上機(jī)檢測(cè)時(shí)間，快速、方便，且靈敏度高，可快速報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。

FilmArray快速呼吸道病原體檢測(cè)技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如肺炎支原體、肺炎衣原體非典型病原體、百日咳鮑特菌培養(yǎng)條件苛刻，而此方法可以快速報(bào)告結(jié)果，對(duì)疑難病例具有重要的臨床指導(dǎo)價(jià)值。本研究結(jié)果表明，人鼻/腸病毒檢測(cè)陽(yáng)性率最高。但由于人鼻病毒與腸病毒的遺傳學(xué)相似性，該檢測(cè)方法不能將這2種病毒區(qū)分開(kāi)，因此人鼻病毒和腸病毒合并為人鼻/腸病毒檢測(cè)[13]。快速病原體檢測(cè)技術(shù)還可以同時(shí)檢測(cè)到多種呼吸道相關(guān)病原體，有利于臨床及時(shí)了解患者感染情況，及時(shí)施治。

在FluA感染暴發(fā)季，F(xiàn)luA抗原篩查是病毒感染篩查的第一步，能更好地對(duì)FluA感染做出初步篩查和診斷。對(duì)于臨床疑似FluA感染或者呼吸道病毒感染患者，可以首先考慮同時(shí)進(jìn)行FluA抗原篩查及FluA核酸檢測(cè)，快速明確病原體，從而預(yù)防性服用奧司他韋。奧司他韋聯(lián)合干擾素治療有利于各項(xiàng)臨床癥狀的消退，且患者耐受，可以提高治療效果。一般來(lái)說(shuō)，奧斯他韋推薦使用5 d，但需要根據(jù)病毒學(xué)檢測(cè)結(jié)果及時(shí)調(diào)整[14]。如遇病情遷延不愈或高度懷疑病毒感染而又暫時(shí)無(wú)法確認(rèn)時(shí)，可以考慮采用FilmArray快速呼吸道病原體檢測(cè)常見(jiàn)呼吸道感染相關(guān)病原體，更好地指導(dǎo)臨床合理使用藥物，對(duì)臨床呼吸道感染患者的診斷和治療有很重要的意義。