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    柚皮素增加自噬抑制泡沫細(xì)胞的形成

    2020-12-03 08:24:14陳雨露杜延飛鄭文武鄭舒展
    天然產(chǎn)物研究與開發(fā) 2020年11期
    關(guān)鍵詞:柚皮素空白對照比值

    陳雨露,杜延飛,鄭文武,李 光,鄭舒展*

    1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科;2西南醫(yī)科大學(xué)心血管研究所,瀘州 646000

    動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性動(dòng)脈疾病,影響動(dòng)脈內(nèi)中外三層膜的功能,它的特征是動(dòng)脈壁上的內(nèi)膜斑塊的增厚和膽固醇的堆積[1]。動(dòng)脈粥樣硬化所致的心血管疾病在西方國家中占有很高的致死率[2]。泡沫細(xì)胞的形成在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵性作用,是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)出現(xiàn)的特征性病理細(xì)胞[3],主要是由單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞吞噬大量氧化修飾的低密度脂蛋白形成,其分泌多種炎癥因子及基質(zhì)代謝酶可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡,破壞纖維的膠原成分,導(dǎo)致粥樣斑塊不穩(wěn)定和急性心血管事件的發(fā)生[4,5]。自噬是細(xì)胞器及蛋白質(zhì)聚集體等細(xì)胞質(zhì)組分通過溶酶體裝置分解和回收的機(jī)制。自噬維持細(xì)胞代謝平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,是一種細(xì)胞修復(fù)過程,自噬功能的缺陷可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[6,7]。柚皮素是天然的黃酮類化合物,對動(dòng)脈粥樣硬化具有保護(hù)作用[8],其作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。本研究觀察柚皮素對泡沫細(xì)胞形成的影響以及探討是否通過自噬途徑發(fā)揮作用,為其防治動(dòng)脈粥樣硬化的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    細(xì)胞株THP-1(human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)(武漢普諾賽生命科技有限公司);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司);青鏈霉素(中國碧云天公司)。

    1.1.2 試劑

    柚皮素(naringenin)(中國思域化工);PMA、3MA(美國Sigma公司);氧化低密度脂蛋白o(hù)x-LDL(廣州奕源生物科技有限公司);cck-8試劑盒(中國碧云天公司);雷帕霉素(rapamycin,Rapa)(美國MedChemExpress公司);compound C、飽和油紅O染色液(中國索萊寶公司);LC3、SQSTM1/p62、AMPK、p-AMPK抗體(美國CST公司);HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗(上海斯信生物科技有限公司)。

    1.1.3 儀器

    Heracell 150i CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo scientific公司);Infinite M200全自動(dòng)酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司);IX71-F22PH倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);SW-CJ-2G型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化公司);低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司);電泳儀(美國Bio-Rad公司);Sim-140制冰機(jī)(日本SANYO公司);BS224S電子天平(德國Sartorius公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 泡沫細(xì)胞模型的構(gòu)建及分組

    使用含10% FBS和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細(xì)胞于CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中,在37 ℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期,然后用160 nmol/L PMA的無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h,使其成為THP-1源性的巨噬細(xì)胞。再將得到的巨噬細(xì)胞用50 μg/mL ox-LDL 3%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h成為泡沫細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)共分為3個(gè)組,第1組為:空白對照組(不加入任何干預(yù)藥物),模型組(加入50 μg/mL ox-LDL),不同濃度的柚皮素組(50 μg/mL ox-LDL+10、25、50、100 μmol/L柚皮素);第2組為:空白對照組,模型組,柚皮素組(50 μg/mL ox-LDL+100 μmol/L柚皮素),雷帕霉素組(50 μg/mL ox-LDL+100 nmol/L雷帕霉素),3MA組(50 μg/mL ox-LDL+5 mmol/L 3MA);第3組為:為空白對照組,模型組,柚皮素組,compound C組(50 μg/mL ox-LDL +10 μmol/L AMPK拮抗劑compound C),柚皮素與compound C共處理組(50 μg/mL ox-LDL +10 μmol/L compound C+100 μmol/L柚皮素)。

    1.2.2 細(xì)胞活性檢測

    將正處于對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞與160 nmol/L PMA的無血清培養(yǎng)基配制成濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,再按照每孔104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板,安置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,再按照CCK-8試劑盒說明書操作,加入不同濃度的柚皮素(0、5、10、25、50、100 μmol/L),用酶標(biāo)儀測定490 nm波長下的光吸收值。

    1.2.3 油紅O染色

    用上述方法將THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞配置成濃度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,按照每個(gè)孔106個(gè)細(xì)胞均勻接種于6孔板中,分為2組,按照上述空白對照組及模型組處理后,用PBS漂洗3次,再用4%多聚甲醛在37 ℃固定15 min,用PBS漂洗2次,油紅O染色25 min,60%異丙醇漂洗5 s,再用PBS漂洗3次。顯微鏡下觀察,按文獻(xiàn)所述:胞內(nèi)較大紅染顆粒≥5個(gè)即可判定為泡沫細(xì)胞[9]。

    1.2.4 Western blot(蛋白質(zhì)免疫印跡法)

    收集上述分組處理好的細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白,并采用BCA法測蛋白濃度。分別使用10%、12%分離膠進(jìn)行凝膠電泳(SDS-PAGE),每孔上樣量為20 μg,按照濃縮膠70 V,分離膠110 V進(jìn)行恒壓電泳,切取需要的膠帶,400 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜上,使用5%脫脂牛奶封閉1 h,將一抗按1∶1 000比例稀釋后于4 ℃孵育過夜,次日用TBST漂洗3次,每次10 min,后用HRP標(biāo)記的羊抗兔或者羊抗鼠二抗(1∶2 000)于室溫孵育2 h,再加TBST搖床洗膜3次,每次10 min,使用化學(xué)發(fā)光法顯影,拍照保存進(jìn)行分析,使用Quantity One圖像分析軟件分析條帶,分析目的蛋白的表達(dá)水平。

    1.2.5 細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量的測定

    將收集的細(xì)胞制成懸液后用1 000 rpm離心10 min,去掉上清液,收集細(xì)胞樣本后使用超聲波破碎細(xì)胞以獲得勻漿液,再按照總膽固醇測定試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量(TC)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 泡沫細(xì)胞模型的建立

    油紅O染色結(jié)果如圖1。結(jié)果表明:空白對照組與模型組相比較,模型組細(xì)胞內(nèi)有大量紅染脂滴顆粒,且胞內(nèi)較大紅染顆?!?個(gè),細(xì)胞模型成功建立。

    圖1 泡沫細(xì)胞模型的建立(油紅O染色,×400)Fig.1 Establishment of foam cell model (oil red O staining,×400)注:A:空白對照組;B:模型組(ox-LDL 50 μmol/L)。Note:A:Control group;B:Model group (ox-LDL 50 μmol/L).

    2.2 不同濃度的柚皮素對細(xì)胞的毒性影響

    使用CCK-8試劑盒測定不同濃度的柚皮素對細(xì)胞的活性影響以排除其毒性影響。結(jié)果見圖2,細(xì)胞活力=[ (加藥細(xì)胞OD-空白OD)/ (對照細(xì)胞OD-空白OD) ] ×100%,結(jié)果表明,當(dāng)柚皮素濃度大于等于5 μmol/L時(shí),柚皮素對細(xì)胞活性無毒性影響,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖2 柚皮素對細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effect of naringenin on cell activity注:與空白對照組相比,P>0.05。Note:Compared with control,P>0.05.

    2.3 柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    2.3.1 不同濃度的柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬的影響

    如圖3所示,與空白對照組相比,模型組LC3II/LC3I比值降低,p62升高(P<0.05);隨著柚皮素濃度的增加,25 μmol/L以上濃度的柚皮素增加泡沫細(xì)胞的自噬水平,主要表現(xiàn)為LC3II/LC3I比值增加,P62蛋白水平降低,在100 μmol/L時(shí)作用最明顯(P<0.05),故選擇100 μmol/L的柚皮素為使用濃度。

    2.3.2 不同濃度柚皮素對泡沫細(xì)胞總膽固醇含量的影響

    如圖4所示,與空白對照組相比,模型組的細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量高(P<0.05),隨著柚皮素濃度增加,泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量逐漸降低,在柚皮素濃度為100 μmol/L時(shí)最低(P<0.05)。

    2.3.3 柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬的影響

    如圖5所示,與空白對照組相比,模型組的LC3II/LC3I的比值降低,P62蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05),自噬水平降低;與模型組相比較,柚皮素組與Rapa組的LC3II/LC3I的比值都增加,3MA組比模型組的LC3II/LC3I的比值降低(P<0.05);柚皮素組與Rapa組相比,LC3II/LC3I的比值更高,并且P62表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05)。

    2.4 柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬影響的機(jī)制探討

    如圖6所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對照組相比較,模型組p-AMPK/AMPK與LC3II/LC3I比值均降低,與模型組相比,柚皮素組p-AMPK/AMPK比值與LC3II/LC3I比值均升高(P<0.05);compound C組與compound C+柚皮素共處理組結(jié)果一致,與模型組相比p-AMPK/AMPK與LC3II/LC3I比值均降低(P<0.05)。

    圖3 不同濃度的柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬的影響Fig.3 Effects of different concentrations of naringenin on autophagy of foam cells注:與空白對照組相比,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05.

    圖4 不同濃度柚皮素對泡沫細(xì)胞膽固醇含量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of naringenin on cholesterol content in foam cells注:與空白對照組相比,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05.

    2.5 柚皮素對泡沫細(xì)胞膽固醇含量的影響

    如圖7所示,模型組比空白對照組的總膽固醇含量增多,而柚皮素組比模型組顯著減少(P<0.05); compound C組與compound C+柚皮素共處理組結(jié)果一致,均為與模型組相比,總膽固醇含量增多(P<0.05)。

    3 討論

    動(dòng)脈粥樣硬化是在動(dòng)脈硬化的血管病中最常見的一種,是由多種病因,多種因素作用于不同環(huán)節(jié)產(chǎn)生,在心血管疾病中,有著很高的死亡率[10]。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制尚未完全確定,但巨噬細(xì)胞相關(guān)膽固醇代謝異常是主要原因之一,動(dòng)脈內(nèi)膜受損,巨噬細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化的起點(diǎn)[11]。

    自噬是一種保守的分解代謝過程,在多種疾病的多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用,可將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器傳遞到溶酶體進(jìn)行降解和循環(huán)[12],對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。過度的自噬已被證明是致病的,許多研究報(bào)道了自噬在冠心病中發(fā)生的意義,自噬可能在冠心病患者血清白蛋白降低的相關(guān)心血管事件中發(fā)揮作用;自噬對冠心病患者的巨噬細(xì)胞內(nèi)低密度脂蛋白的降解有保護(hù)作用[13-15]。但自噬在動(dòng)脈粥樣硬化中的具體作用機(jī)制尚不明確。研究表明,自噬延緩了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程,但是有缺陷的自噬加快了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[16,17]。

    柚皮素是天然的黃酮類化合物,主要存在于葡

    圖5 柚皮素促進(jìn)泡沫細(xì)胞自噬Fig.5 Naringenin promotes autophagy of foam cells注:與空白對照組相比,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與Rapa組比較,▲P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05;Compared with Rapa,▲P<0.05.

    圖6 柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬影響的機(jī)制探討Fig.6 Mechanism of effect of naringenin on autophagy of foam cells注:與空白對照組相比,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05.

    萄柚和橙子中,它的結(jié)構(gòu)與廣泛研究的多酚白藜蘆醇相似,具有潛在的健康益處[18],有研究表明,柚皮素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[19],柚皮素可以增加THP-1源性巨噬細(xì)胞的膽固醇外排[20]。但柚皮素防治動(dòng)脈粥樣硬化的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究,鑒于黃酮類化合物可能有促進(jìn)自噬活性的作用[21,22],我們推測,柚皮素可能通過增加自噬來減輕粥樣硬化斑塊病變,從而對動(dòng)脈粥樣硬化起保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明,泡沫細(xì)胞的形成伴有自噬能力的受損,表現(xiàn)為LC3II/LC3I比值降低,P62水平升高。25 μM以上濃度的柚皮素呈濃度依賴性的增加巨噬細(xì)胞自噬流水平,在100 μM作用最強(qiáng)。與自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素相比,柚皮素升高LC3II的作用更明顯。同時(shí)25 μM以上濃度的柚皮素濃度依耐性地降低巨噬細(xì)胞內(nèi)總膽固醇的含量,抑制泡沫細(xì)胞的形成。

    圖7 柚皮素對泡沫細(xì)胞膽固醇含量的影響Fig.7 Effect of naringenin on cholesterol content of foam cells注:與空白對照組相比,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。Note:Compared with control, *P<0.05;Compared with model, #P<0.05.

    為進(jìn)一步探討柚皮素促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬的機(jī)制,我們選擇自噬通路的調(diào)節(jié)因子AMPK作為觀察指標(biāo)。AMPK是細(xì)胞能量代謝的傳感器,調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝以維持能量穩(wěn)態(tài),包括脂質(zhì)代謝,并通過ULK-1激活自噬,并且促進(jìn)自噬[23]。Wu等[24]研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚通過上調(diào)自噬和激活A(yù)MPK磷酸化來達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用,還有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,黃連素可以通過激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)的自噬來預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[25],而且morin可通過激活HUVECs中的AMPK信號(hào)通路,誘導(dǎo)自噬,從而減輕ox-LDL介導(dǎo)的損傷[26]。本研究結(jié)果顯示,AMPK抑制劑compound C可降低磷酸化AMPK的水平,降低LC3II/LC3I的比值;增加泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。說明AMPK可能通過影響自噬參與巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的調(diào)節(jié)。而柚皮素能夠增加泡沫細(xì)胞內(nèi)磷酸化AMPK的水平,促進(jìn)自噬。另外,將柚皮素處理的泡沫細(xì)胞預(yù)防性加入AMPK抑制劑compound C,compound C抑制了柚皮素對泡沫細(xì)胞的降膽固醇作用。說明柚皮素通過增加AMPK磷酸化而促進(jìn)自噬。

    綜上,柚皮素的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用可能與其增加泡沫細(xì)胞的自噬有關(guān),柚皮素可通過增加AMPK磷酸化水平促進(jìn)自噬,進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化中泡沫細(xì)胞的形成,延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。

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