蛋白質(zhì)組學及其在啤酒大麥和麥芽研究中的應用綜述

朱天地　李靜雯　葉春雷　陳軍　王立光

摘要：啤酒的釀造和質(zhì)量直接受到啤酒大麥品質(zhì)的影響。隨著系統(tǒng)生物學和生物信息學的發(fā)展，啤酒大麥和麥芽的蛋白質(zhì)組學正日益成為研究熱點。對蛋白質(zhì)組學及研究方法，及其在啤酒大麥品種鑒定、質(zhì)量分析、麥芽制造和品質(zhì)影響研究中的應用進展進行了概述，展望啤酒大麥及麥芽中蛋白質(zhì)組今后的研究方向進行。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學;啤酒大麥;麥芽;研究進展

中圖分類號：S512.3? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? 文章編號：1001-1463（2019）12-0071-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2019.12.018

Review of Proteomics and Its Applications in Research of Malting Barley and Malt

ZHU Tiandi， LI Jingwen， YE Chunlei， CHEN Jun， WANG Liguang

（Institute of Biotechnology， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：The brewing and quality of beer is directly affected by the quality of beer barley. With the development of system biology and bioinformatics， proteomics of malting barley and malt are becoming a research hotpot and have made important progress. In this paper， the proteomics and research methods， as well as its application in variety identification， quality analysis malt manufacture and quality impact of malting barley were summarized， and the future research direction of proteomics in beer barley and malt was prospected.

Key words：Proteomics; Malting barley;Malt;Research progress

啤酒大麥是釀造啤酒的主要原料，啤酒的釀造和質(zhì)量直接受到啤酒大麥品質(zhì)的影響。啤酒大麥經(jīng)過浸麥、發(fā)芽和焙焦等工藝制成麥芽。在啤酒大麥的制麥過程中使α-淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶等水解酶的活力顯著提高，由于啤酒大麥的酶活性和種類的增加，導致麥粒中的大分子物質(zhì)如淀粉、多糖和蛋白質(zhì)等得到一定的降解，同時也使麥芽糖化過程中的大分子物質(zhì)更容易水解成小分子物質(zhì)以供酵母利用[1 - 2 ]。因此，蛋白質(zhì)作為啤酒大麥的主要成分之一，在制麥、糖化和釀造過程中起著重要作用，尤其對麥芽和啤酒質(zhì)量至關(guān)重要。

近年來，隨著系統(tǒng)生物學和生物信息學的發(fā)展，啤酒大麥和麥芽的蛋白質(zhì)組學正日益成為研究熱點，蛋白質(zhì)組學及相關(guān)技術(shù)已在啤酒大麥和麥芽研究中得到較為廣泛的應用，由以往研究個別蛋白質(zhì)的“釣魚”模式向“一網(wǎng)打盡”的“蛋白質(zhì)組學”新模式轉(zhuǎn)變[3 ]。這不僅可以揭示啤酒大麥、麥芽和啤酒品質(zhì)之間的相互關(guān)系，也為啤酒大麥育種、制麥和釀造工藝的改善等方面的研究奠定基礎(chǔ)。我們對蛋白質(zhì)組學及其在啤酒大麥品種鑒定和質(zhì)量分析，麥芽制造和品質(zhì)影響研究中的應用進展進行了綜述，以期為推動蛋白質(zhì)組學技術(shù)在啤酒大麥及麥芽等方面的研究提供參考。

1? ?蛋白質(zhì)組學及研究方法

1.1? ?蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學

蛋白質(zhì)在細胞的結(jié)構(gòu)和功能中起著至關(guān)重要的作用，與核酸、碳水化合物和脂質(zhì)一起構(gòu)成生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)包括酶、激素和抗體等成分，是生物體正常運轉(zhuǎn)所必需的[4 ]。蛋白質(zhì)組的概念最初由Wilkins和Williams于1994年提出，是指細胞、組織或有機體中表達的所有蛋白質(zhì)[5 ]。對于蛋白質(zhì)組的研究稱為蛋白質(zhì)組學，包括對蛋白質(zhì)的特性、數(shù)量和功能等的系統(tǒng)分析。蛋白質(zhì)組學可分為：（1）表達蛋白質(zhì)組學，即對生物體不同細胞類型中蛋白質(zhì)表達量化譜的反映;（2）結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學，包括蛋白質(zhì)在亞細胞室中的分布、蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和蛋白質(zhì)的相互作用;（3）功能蛋白質(zhì)組學，即蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間相互關(guān)系的分析[6 ]。

細胞通常依賴多種代謝和調(diào)節(jié)途徑生存，而蛋白質(zhì)組反映了生物系統(tǒng)發(fā)生的過程，因此通過了解蛋白質(zhì)組概況可以更好地了解代謝過程及其與生物系統(tǒng)中其他調(diào)節(jié)途徑的相互作用，可以定性和定量地判定特定細胞類型或細胞器在特定發(fā)育和生理階段以及相互作用中的重要蛋白質(zhì)組[7 - 8 ]。蛋白質(zhì)組學對植物科學發(fā)展有著積極的影響。從玉米的第一個植物蛋白質(zhì)組學研究開始，已經(jīng)取得了快速的發(fā)展，但植物蛋白質(zhì)組學的潛力還遠未被充分開發(fā)，特別是與人類和酵母蛋白質(zhì)組學相比，植物蛋白質(zhì)組學遠遠落后[9 - 10 ]。目前，蛋白質(zhì)組學已在大麥品種鑒定和麥芽品質(zhì)分析等方面取得了一定的進展。

1.2? ?蛋白質(zhì)組學研究的常見方法

蛋白質(zhì)組學分析主要包括凝膠分析和非凝膠分析。基于凝膠的蛋白質(zhì)組學技術(shù)通過凝膠電泳進行初始蛋白質(zhì)分離、定量、蛋白質(zhì)點消化和質(zhì)譜鑒定，是蛋白質(zhì)組學分析最常用的方法，包括雙向凝膠電泳（2-DE）和熒光差異凝膠電泳技術(shù)（2D-DIGE）[11 - 12 ]。2-DE技術(shù)根據(jù)等電點（pI）和分子量（Mr）解析蛋白質(zhì)，所分離的蛋白點可以采用考馬斯亮藍、銀染等染色[13 ]。當與先進的MS技術(shù)相結(jié)合時，2-DE允許數(shù)百種蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中進行特征化，包括pI和Mr在凝膠上的位置，這種2-DE功能允許分析蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，2D-DIGE的出現(xiàn)提高了2-DE的可重復性和靈敏性。每個蛋白質(zhì)樣品都進行不同熒光染料的標記，如CyDye2、CyDye3、CyDye5，在同一凝膠上混合和分離之前，可以很容易地通過不同的熒光染料確定不同樣品中相同蛋白質(zhì)的豐度[14 ]。這種技術(shù)可以減少所需的凝膠數(shù)量，避免不同凝膠間的差異對實驗結(jié)果分析帶來困難。

盡管凝膠分析取得了成功，但該方法仍有許多局限性[15 ]。例如，采用2-DE分離得到的蛋白質(zhì)只占整個蛋白質(zhì)的30%～50%，且無法分離復雜樣本中的所有蛋白質(zhì)[16 ]。實際上，使用2-DE技術(shù)蛋白質(zhì)組總覆蓋率僅限于具有Mr為10-120 kDa、pI為中性至酸性的蛋白質(zhì)。同時，具有生理相關(guān)性的低豐度蛋白質(zhì)（主要包括調(diào)節(jié)蛋白和信號傳遞蛋白）也很少在傳統(tǒng)的2-DE凝膠上檢測到，這是由于大量高豐度蛋白質(zhì)掩蓋了它們的檢測[17 ]。例如，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）占植物總蛋白的很大比例，阻礙IPG膠條上低豐度蛋白質(zhì)的吸收，導致這些蛋白的檢測和識別困難[18 ]。

蛋白質(zhì)組學研究面臨的挑戰(zhàn)不能單靠凝膠化策略來解決，而基于凝膠的蛋白組學方法的缺點促使了替代無凝膠蛋白組學技術(shù)的發(fā)展，以克服限制或完全取代基于凝膠的技術(shù)[19 ]。無凝膠方法包括化學標記、代謝標記和非標記定量方法?；瘜W標記包括同位素親和標簽技術(shù)（ICAT）、等量標記的相對和絕對定量技術(shù)（iTRAQ）、串聯(lián)質(zhì)譜標簽 （TMT）;代謝標簽方法包括細胞培養(yǎng)的氨基酸穩(wěn)定同尾數(shù)標記技術(shù)（SILAC）和15N標簽。非標記定量蛋白組學（Label-free）是通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對蛋白質(zhì)酶解肽段進行質(zhì)譜分析，無須同位素標簽做內(nèi)部標準，通過分析大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)時所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進行不同樣品中相應肽段信號強度的比較，從而對肽段對應的蛋白質(zhì)進行相對定量[20 ]。無凝膠方法比基于凝膠方法更具可重復性，并且表現(xiàn)出更少的偏差。所有這些凝膠或無凝膠技術(shù)均存在優(yōu)點和缺點，每種方法都應根據(jù)實驗目的和樣本類型進行選擇[21 ]。

2? ?蛋白質(zhì)組學在啤酒大麥及麥芽研究中的應用

2.1? ?啤酒大麥品種鑒定與品質(zhì)分析的蛋白質(zhì)組學研究

啤酒大麥品質(zhì)受基因型和環(huán)境因素及其相互作用的影響，人們對于培育具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、耐生物和非生物脅迫以及適應不同氣候的啤酒大麥品種非常感興趣[22 - 23 ]。2-DE技術(shù)早期應用于啤酒大麥種子蛋白質(zhì)的研究，確定了啤酒大麥品種、質(zhì)量存在差異的不同種子蛋白，探明蛋白質(zhì)組在品種、品質(zhì)和遺傳圖譜之間的相關(guān)性。蛋白質(zhì)組分析可用于識別目標蛋白質(zhì)，從而對種子中特定蛋白質(zhì)（β-淀粉酶、過氧化物酶、硫氧還蛋白）進行深入分析[24 ]。不同品種啤酒大麥的蛋白質(zhì)組存在差異。利用2-DE 技術(shù)對18個不同特性啤酒大麥品種的蛋白質(zhì)組進行分析發(fā)現(xiàn)，在pI為4-7和6-11的蛋白圖譜中存在69個差異蛋白點，其中48個蛋白點被鑒定，另外品種差異可能是由于在質(zhì)譜鑒定時單核苷酸多態(tài)性（SNPs）引起編碼氨基酸的改變，或相應蛋白質(zhì)pI和功能的變化。因此，這種“編碼SNPs”代表了將基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)耦合的一種手段[25 - 26 ]。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，Ondrej 等[27 ]利用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）進行了啤酒大麥蛋白質(zhì)指紋識別和鑒別：通過對20個大麥品種鑒定的結(jié)果進行聚類分析，建立大麥品種的鑒別方法，并對60個大麥樣品進行了驗證，證實了該方法的適用性。該方法被認為是一種快速鑒別大麥品種的工具，可用于大麥的品種分配和純度測定，有著較高靈敏度和準確性，可以取代常用的凝膠電泳技術(shù)[27 ]。游麗華[28 ]利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對7 種澳大利亞啤酒大麥和 4 種國產(chǎn)啤酒大麥的醇溶蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)澳大利亞啤酒大麥與國產(chǎn)大啤酒麥醇溶蛋白圖譜間差異明顯，并對澳大利亞啤酒大麥醇溶蛋白的差異蛋白點進行質(zhì)譜鑒定，成功鑒定出的共同蛋白點和特異蛋白點分別為34個和13個，這些鑒定成功的蛋白點構(gòu)成了7 個澳大利亞啤酒大麥品種的蛋白標志物庫。同時，利用實時定量 PCR技術(shù)對不同啤酒大麥品種的標志蛋白進行驗證，以達到對啤酒大麥品種的鑒定和純度檢測。

為了全面獲取啤酒大麥種子中蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)，通過納升級液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分別對六棱啤酒大麥和二棱啤酒大麥中經(jīng)蛋白質(zhì)消化產(chǎn)生的多肽進行鑒定，識別的1 168種蛋白質(zhì)中有900種為“未知功能蛋白”或預測蛋白，其中六棱啤酒大麥和二棱啤酒大麥品種中僅有20種差異蛋白質(zhì)，GO分析表明，大多數(shù)啤酒大麥種子蛋白存在于細胞質(zhì)基質(zhì)，具有催化活性，與碳水化合物代謝相 關(guān)[29 ]。該技術(shù)為無凝膠蛋白質(zhì)組學策略在進行啤酒大麥品種區(qū)分和品質(zhì)分析中的應用奠定了基礎(chǔ)。

2.2? ?麥芽制造及品質(zhì)分析的蛋白質(zhì)組學研究

啤酒大麥在適宜的溫度和濕度條件下發(fā)芽，產(chǎn)生分解淀粉的酶，并將淀粉降解為低分子量的碳水化合物。發(fā)芽至5 d時產(chǎn)生所謂的“綠色麥芽”，最后經(jīng)過干燥與焙焦制成麥芽。麥芽制造及品質(zhì)對啤酒品質(zhì)的影響至關(guān)重要。

Jin等[30 ]分別對麥芽質(zhì)量存在顯著差異的甘啤大麥和Baudin麥芽進行2-DE分析，在2-DE凝膠中分別檢測到333個和354個蛋白點，約90%的蛋白點為2種麥芽所共有，并利用質(zhì)譜鑒定技術(shù)成功鑒定到192種蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)是酶和酶抑制劑。同時發(fā)現(xiàn)Baudin麥芽含有比甘啤麥芽更多的淀粉水解酶、病程相關(guān)蛋白質(zhì)。此外，參與糖酵解和氧化還原通路的酶在2種麥芽之間表現(xiàn)出顯著不同的特征，從而可以更深入地闡明差異蛋白和麥芽質(zhì)量之間的關(guān)系[30 ]。劉寶祥等[31 ]通過雙向電泳技術(shù)對澳大利亞啤酒大麥品種Schooner發(fā)芽過程中的水溶蛋白質(zhì)組進行分析發(fā)現(xiàn)，啤酒大麥種子中大約有 804 種蛋白質(zhì)，發(fā)芽過程中有379 種蛋白質(zhì)降解消失或濃度降低，有 77 種蛋白質(zhì)激活或產(chǎn)生，表明浸麥階段主要是蛋白質(zhì)的降解過程;發(fā)芽前期蛋白質(zhì)的降解和合成轉(zhuǎn)化較為緩慢，發(fā)芽中期蛋白質(zhì)的降解最顯著;發(fā)芽后期蛋白質(zhì)的變化基本趨于平衡。

Li等[32 ]通過2D-DIGE技術(shù)對啤酒大麥品種Dan'er的2種不同制麥過程中的蛋白質(zhì)組進行分析，發(fā)現(xiàn)2種制麥工藝中參與細胞壁多糖降解的酶及淀粉和蛋白水解酶存在差異，特別是對于麥芽過濾性、糖化時間和糖化力的影響較大。Jin等[33 ]通過2D-DIGE技術(shù)分析比較了過濾性能存在顯著差異的2個啤酒大麥品種Dan'er 和 Metcalfe麥芽的蛋白質(zhì)組，并確定了51個差異蛋白點，通過質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白點主要包括水解酶和病程相關(guān)蛋白。根據(jù)它們的功能分析和豐度比較，提出了可能與過濾性能相關(guān)的蛋白質(zhì)，這是首次全面調(diào)查與大麥麥芽過濾性有關(guān)的代謝蛋白，并揭示了過濾性可追溯性的線索 [33 ]。

通過納升級液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)對制麥過程的5個時期中的所有蛋白質(zhì)進行分析，共鑒定了1 418種蛋白質(zhì)，其中大約900種蛋白質(zhì)是未知或預測蛋白。通過數(shù)據(jù)庫查詢，提供了796種預測和未知的蛋白質(zhì)的功能注釋。近63%的已識別蛋白質(zhì)存在于整個制麥過程中，表明在制麥期間主要參與代謝的相關(guān)蛋白質(zhì)和酶被激活，并且其中205種蛋白質(zhì)的豐度存在顯著差異。這些蛋白質(zhì)主要參與糖代謝途徑，特別是酶活性調(diào)節(jié)，為麥芽大麥育種和預測麥芽質(zhì)量提供了新穎的思路[34 ]。Strouhalova等[35 ]通過iTRAQ技術(shù)研究了啤酒大麥在制麥前后關(guān)鍵蛋白質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)大麥和麥芽β-淀粉酶、β-葡聚糖酶和兩種不同形式的蛋白質(zhì)Z（Z4、Z7）差異明顯。與β-葡聚糖酶相比，β-淀粉酶的含量增加得更快，而蛋白質(zhì)Z7似乎有相反的趨勢，蛋白質(zhì)Z4呈現(xiàn)增加趨勢，蛋白質(zhì)Z7呈遞減趨勢。

3? ?展望

隨著蛋白質(zhì)組學技術(shù)進一步的完善和發(fā)展，蛋白質(zhì)組學在有關(guān)植物生長的分子機制和生化過程、不同植物物種的應激反應以及植物育種的研究中發(fā)揮越來越重要的作用，且在耐受性作物和具有重要商業(yè)價值作物的研究中也發(fā)揮著重要的作用。蛋白質(zhì)組學豐富其與轉(zhuǎn)錄組、基因組和代謝組的數(shù)據(jù)庫相互聯(lián)系，形成系統(tǒng)生物學關(guān)聯(lián)性。采用蛋白質(zhì)組分析與轉(zhuǎn)錄組學、種子組成和質(zhì)量分析多技術(shù)相結(jié)合，從多角度、多層次進行全組分研究，使育種研究中提高作物的農(nóng)藝特性成為可能。

已有的研究充分表明，應用蛋白質(zhì)組學方法研究啤酒大麥和麥芽品種的差異、品質(zhì)具有傳統(tǒng)研究方法無法比擬的優(yōu)勢。啤酒大麥及麥芽中的蛋白質(zhì)種類繁多，蛋白質(zhì)之間的相互作用復雜，如何對樣品中感興趣的蛋白質(zhì)進行制備并最大程度進行分離和準確鑒定，進一步研究目標蛋白質(zhì)在啤酒大麥和麥芽中的變化情況和發(fā)揮作用的影響因素，將是今后啤酒大麥及麥芽中蛋白質(zhì)組研究的重要內(nèi)容。同時，隨著對啤酒大麥及麥芽蛋白質(zhì)組學研究的深入，各種分析檢測手段更新和生物信息學豐富，蛋白質(zhì)組學必將為其提供全面、多維的角度，為人們從整體、全面的視角理解啤酒大麥及麥芽蛋白質(zhì)提供無限可能。

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（本文責編：鄭立龍）

收稿日期：2019 - 08 - 22

基金項目：國家自然科學基金（31660391、31460350）。

作者簡介：朱天地（1988 — ），女，黑龍江望奎人，研究實習員，碩士，主要從事植物分子生物學研究工作。Email：kaoyanlaile@163.com。

通信作者：李靜雯（1979 — ），女，甘肅榆中人，助理研究員，主要從事植物分子生物學研究工作。Email：lj-lg614@163.com。