骨疏寧口服液的薄層鑒別和含量測定方法研究*

吳勇梅，何 科，徐 錦，韋玉燕

(玉林市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院，廣西 玉林 537000)

骨疏寧方是我院名老中醫(yī)賴祥林的驗方，由淫羊藿、骨碎補(bǔ)、制何首烏、丹參、續(xù)斷等19味中藥組成，具有益陰助陽，補(bǔ)腎壯陽、活血化瘀、通絡(luò)鎮(zhèn)痛等功效，主治老年骨質(zhì)疏松所致之腰腿疼痛，頸痿肩累，周身痿痛，肢體乏力，失眠健忘，夜尿多等癥[1]，療效確切。該方原劑型為片劑[2]，為了滿足不方便吞咽片劑的患者需求，將其增加液體劑型為骨疏寧口服液。前期已完成骨疏寧口服液的工藝研究[3]，為有效控制該制劑的質(zhì)量，本實驗采用TLC對處方中主藥淫羊藿、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷和丹參藥材進(jìn)行定性鑒別；淫羊藿骨碎補(bǔ)為方中君藥，有效成分分別為淫羊藿苷和柚皮苷，具有確切的抗骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨愈合的作用[4-5]，因此淫羊藿苷和柚皮苷的含量可作為評價骨疏寧口服液質(zhì)量的指標(biāo)之一，采用 HPLC 同時測定淫羊藿苷和柚皮苷的含量。本實驗方法操作簡便、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，為骨疏寧口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有效檢測方法。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

U3000高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；XS-205Du型電子分析天平，瑞士梅特勒公司；Millipore Simplicity-UV超純水器，美國密里博公司；SB3200-T超聲波清洗器，上海必能信超聲公司；硅膠G薄層板，青島海洋化工廠；聚酰胺薄膜，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠。

1.2 材 料

骨疏寧口服液，批號：20180103、20180104、20180108、20180109、20180110、20180111，玉林市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院自制；對照品淫羊藿苷(批號110737-200415)、柚皮苷(批號110722-200309)、川續(xù)斷皂苷Ⅵ(批號：111685-201003)、丹酚酸B(批號：111562-201111)和對照藥材淫羊藿(批號：121632-201101)、骨碎補(bǔ)(批號：121169-200503)、丹參(批號：120923-200408)、續(xù)斷(批號：121033-200304)均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈(色譜純)，F(xiàn)isher公司；冰醋酸(色譜純)，西隴化工股份有限公司；其他試劑均為分析純，高效液相色譜儀用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 淫羊藿的TLC鑒別

取骨疏寧口服液20 mL，加水飽和的正丁醇20 mL振搖提取，分取正丁醇液，重復(fù)提取一次，合并2次正丁醇液，用40 mL氨試液洗滌，取正丁醇液，重復(fù)洗滌1次，取正丁醇液用40 mL正丁醇飽和的水洗滌，分取正丁醇液，重復(fù)洗滌1次，取正丁醇液在水浴上蒸干得殘渣，加甲醇1 mL使溶解得供試品溶液。按處方比例分別稱取除淫羊藿以外的藥味，按制備工藝制備陰性樣品，同供試品提取方法制得缺淫羊藿陰性對照品溶液。取淫羊藿對照藥材0.5 g，加水煎煮2次，每次加50 mL水煎煮1 h后濾過，合并濾液，在水浴上濃縮成大約30 mL的溶液，同供試品提取方法制成對照藥材溶液。取淫羊藿苷對照品加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。分別取上述四種溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板，用展開劑甲醇-丁酮-三氯甲烷-水-甲酸(4：6：6：1：0.5)溶液展開，取出晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，用熱風(fēng)吹干后在紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的、清晰的熒光斑點，陰性樣品對照無干擾，說明本鑒別方法可行。結(jié)果見圖1。

圖1 淫羊藿的TLC鑒別色譜圖

2.1.2 續(xù)斷的TLC鑒別

取2.1.1淫羊藿TLC鑒別項下的供試品溶液作為供試品溶液。取續(xù)斷對照藥材1 g，加水煎煮2次，每次加50 mL水煎煮1 h后濾過，合并濾液，在水浴上濃縮成大約20 mL的溶液，按2.1.1淫羊藿TLC鑒別項下制備供試品溶液的方法制成對照藥材溶液。取續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。按處方比例分別稱取除續(xù)斷以外的藥味，按制備工藝制備陰性樣品，同供試品提取方法制得缺續(xù)斷陰性對照品溶液。分別取上述四種溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板，以展開劑三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10 ℃冷藏過夜的下層溶液展開，取出晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，然后置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色、清晰的主斑點，陰性樣品對照無干擾，說明本鑒別方法可行。結(jié)果見圖2。

圖2 續(xù)斷的TLC鑒別色譜圖

2.1.3 骨碎補(bǔ)的TLC鑒別

取骨疏寧口服液20 mL，加乙酸乙酯20 mL振搖提取，重復(fù)1次，合并乙酸乙酯液，在水浴上蒸干得殘渣，加甲醇1 mL使溶解得供試品溶液。按處方比例分別稱取除骨碎補(bǔ)以外的藥味，按制備工藝制備陰性樣品，同供試品提取方法制得缺骨碎補(bǔ)陰性對照品溶液。取骨碎補(bǔ)對照藥材1 g，加水煎煮2次，每次加50 mL水煎煮1 h后濾過，合并濾液，在水浴上濃縮成大約20 mL的溶液，同供試品提取方法制成對照藥材溶液。取柚皮苷對照品適量加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。分別取上述四種溶液各10 μL點于同一聚酰胺薄膜，以展開劑三氯甲烷-丙酮-甲醇(4：1：1)溶液展開，取出晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，在紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的、清晰的熒光斑點，陰性樣品對照無干擾，說明本鑒別方法可行。結(jié)果見圖3。

圖3 骨碎補(bǔ)的TLC鑒別色譜圖

2.1.4 丹參的TLC鑒別

取骨疏寧口服液10 mL，加15 mL石油醚(60～90 ℃)振搖提取，取水層加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，再加乙醚10 mL振搖提取，重復(fù)1次，合并乙醚液，揮干乙醚得殘渣，加甲醇5 mL使溶解得供試品溶液。按處方比例分別稱取除丹參以外的藥味，按制備工藝制備陰性樣品，同供試品提取方法制得缺丹參陰性對照品溶液。取丹參對照藥材0.1 g，加水煎煮2次，每次加50 mL水煎煮1小時后濾過，合并濾液，在水浴上濃縮成大約20 mL的溶液，同供試品提取方法制成對照藥材溶液。取丹酚酸B對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。分別吸取上述四種溶液各1～2 μL，點于同一聚酰胺薄膜，使成條狀，以展開劑丙酮-水-甲酸(40：10：1)展開，取出晾干，放置氨氣中熏15秒鐘，在紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的、清晰的熒光主斑點，陰性樣品對照無干擾，說明本鑒別方法可行。結(jié)果見圖4。

圖4 丹參的TLC鑒別色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

色譜柱為C18柱(Agilent EtlipseXDB-C18，5 μm，4.6×150 mm)，流動相為乙腈-0.5%冰醋酸溶液梯度洗脫(乙腈體積分?jǐn)?shù)在0～20 min為15%～60%)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測波長為285 nm，進(jìn)樣量為10 μL。在此條件下，以柚皮苷峰計算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于5000。

2.2.2 對照品溶液制備

精密稱取柚皮苷0.01039 g和淫羊藿苷對照品0.01007 g，分別置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得柚皮苷對照品貯備液和淫羊藿苷對照品貯備液。分別精密量取2 mL貯備液置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得每1 mL含柚皮苷0.1039 mg、含淫羊藿苷0.1007 mg的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

精密量取骨疏寧口服液10 mL，置聚酰胺層析柱(100～200目，6 g，內(nèi)徑為1.5 cm)上，用蒸餾水100 mL洗脫，水洗液棄去，再用95%乙醇100 mL洗脫，收集醇洗脫液，蒸干得殘渣，用甲醇溶解，定量轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中并定容，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液制備

按處方比例分別稱取除骨碎補(bǔ)和淫羊藿以外的其余藥味，按制備工藝制備陰性樣品，按“2.2.3供試品溶液制備”方法制備陰性對照溶液。

2.2.5 測定方法

分別精密吸取上述供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各10 μL，在上述色譜條件下，供試品中柚皮苷和淫羊藿苷色譜峰與對照品色譜峰保留時間一致，與其它成分的分離度大于1.5。色譜圖見圖5(a)～圖5(c)。

圖5 對照品(a)，供試品(b)和陰性對照(c)的HPLC色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述柚皮苷和淫羊藿苷混合對照品溶液(每1 mL含柚皮苷0.1039 mg、含淫羊藿苷0.1007 mg)1、5、10、15、20、25 μL，進(jìn)樣測定柚皮苷和淫羊藿苷峰面積，以進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得柚皮苷回歸方程：y=229.3x+2.032，r=0.9993；淫羊藿苷回歸方程：y=176.8x+0.175，r=0.9999。結(jié)果表明柚皮苷對照品進(jìn)樣量在0.1039～2.5975 μg之間與峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，淫羊藿苷對照品進(jìn)樣量在0.1007～2.5175 μg之間與峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗

精密量取骨疏寧口服液10 mL，按“2.2.3供試品溶液制備”方法制備，精密吸取10 μL，按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果柚皮苷平均峰面積值為296.812，RSD為0.4%，淫羊藿苷平均峰面積值為221.486，RSD為0.3%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗

取上述供試品溶液，每次精密吸取10 μL，分別于1，2，4，6，12，24 h進(jìn)樣，按2.2.1項下色譜條件測定柚皮苷和淫羊藿苷峰面積并計算其含量，在24 h內(nèi)柚皮苷平均含量為0.1279 mg·mL-1，RSD為1.6%，淫羊藿苷平均含量為0.1242 mg·mL-1，RSD為0.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗

取同一批號骨疏寧口服液6份，分別精密量取10 mL，按“2.2.3供試品制備”方法制備，精密吸取10 μL，進(jìn)樣按2.2.1項下色譜條件測定柚皮苷和淫羊藿苷峰面積并計算其含量，結(jié)果柚皮苷平均含量為0.1340 mg·mL-1，RSD為4.0%，淫羊藿苷平均含量為0.1250 mg·mL-1，RSD為1.0%。表明本法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收試驗

取已知含量(柚皮苷含量為0.1340 mg·mL-1，淫羊藿苷含量為0.1250 mg·mL-1)的骨疏寧口服液6份，每份精密量取5 mL，分別加入一定量的柚皮苷和淫羊藿苷對照品，按“2.2.3供試品溶液制備”方法處理，精密吸取10 μL，進(jìn)樣按2.2.1項下色譜條件測定柚皮苷和淫羊藿苷峰面積并計算回收率，柚皮苷平均回收率為99.70%，RSD為1.4%，淫羊藿苷平均回收率為99.78%，RSD為1.2%，表明本法系統(tǒng)誤差較小。結(jié)果見表1、表2。

表1 供試品柚皮苷回收率試驗結(jié)果

表2 供試品淫羊藿苷回收率試驗結(jié)果

2.2.11 樣品含量測定

分別取6個不同批次的骨疏寧口服液各一份，每份精密量取10 mL，按“2.2.3供試品制備”方法制備，精密吸取10 μL，進(jìn)樣按2.2.1項下色譜條件測定柚皮苷和淫羊藿苷峰面積并計算含量。結(jié)果見表3。

表3 6批樣品測定結(jié)果

3 結(jié) 論

3.1 薄層色譜條件的選擇

淫羊藿的TLC鑒別[6-7]，曾嘗試以乙酸乙酯-丁酮-甲酸(10：1：1：1)溶液以及續(xù)斷的展開劑三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10 ℃冷藏過夜的下層溶液展開，但分離效果均不理想，最終以甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸(4：6：6：1：0.5)溶液展開，達(dá)到最佳分離效果。

續(xù)斷的TLC鑒別[8-11]，同時考察了四種展開劑，分別是三氯甲烷-正丁醇-甲醇-水(2：3：1：3)下層溶液、正丁醇-醋酸-水(50：10：40)上層溶液、乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-水(40：15：22：10)10 ℃冷藏過夜的下層溶液、三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10 ℃冷藏過夜的下層溶液，結(jié)果以三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10 ℃冷藏過夜的下層溶液為展開劑分離效果最好。續(xù)斷初步考察的提取方法與淫羊藿提取方法接近，確定展開劑后，嘗試以淫羊藿鑒別項下供試液為續(xù)斷鑒別供試液，結(jié)果兩種提取方法的斑點分離效果和清晰度沒有差異，最終確定續(xù)斷與淫羊藿共用供試液，提取一次樣品用不同展開劑展開可鑒別續(xù)斷和淫羊藿兩種成分。

骨碎補(bǔ)的TLC鑒別[11-12]，分別考察了乙酸乙酯提取以及水飽和的正丁醇提取兩種方法，結(jié)果乙酸乙酯提取法的斑點分離效果好，水飽和的正丁醇提取未能分離斑點。展開劑三氯甲烷-丙酮-甲醇(5：1：1)溶液展開的比移值偏小，調(diào)整為4：1：1展開后，比移值適中，各成分斑點均能較好分離，但斑點不夠清晰。改用聚酰胺薄膜代替硅膠G薄層板展開，各成分均能分離，斑點清晰，陰性對照無干擾。

丹參的藥理活性成分主要分為兩大類，即脂溶性成分及水溶性成分。脂溶性成分：丹參酮I、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮等；水溶性成分：丹酚酸A，B，C、丹參素及原兒茶醛等[13]。丹參的TLC鑒別，曾參照《中國藥典》2015年版一部丹參鑒別項下丹參酮ⅡA成分的薄層鑒別方法，但供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，未見相同的暗紅色斑點，可能受供試品的制備工藝影響，丹參酮ⅡA屬于脂溶性成分，供試品提取工藝所用水煮的方法不能將其提取出來或能提取出來的量較少，故此法不可用。而參照《中國藥典》2015年版一部丹參鑒別項下用丹酚酸B成分進(jìn)行鑒別，但供試品部分斑點未完全分開，陰性有部分斑點干擾，不可用。參考含有丹參成分的其他中藥處方中丹酚酸B的檢出條件[14]，對提取溶劑乙酸乙酯、乙醚等溶劑進(jìn)行考察，最終形成上述丹參的薄層色譜鑒別方法。由于點成點狀樣品和對照品展開后都嚴(yán)重拖尾，點成條狀后可以解決。

3.2 HPLC提取條件選擇

由于骨疏寧口服液含有19味藥材，成分過于復(fù)雜，采用超聲與回流等常規(guī)提取方法，提取液中雜質(zhì)干擾較多，并且在柚皮苷峰處有干擾。因此采用聚酰胺進(jìn)行凈化處理，先用蒸餾水洗脫，除去雜質(zhì)，再用95%乙醇洗脫[15]。制得的供試品溶液提取率高，且提取液中雜質(zhì)干擾較少。

3.3 HPLC洗脫條件選擇[16-18]

曾對乙腈-水、乙腈-0.5%冰醋酸溶液流動相進(jìn)行了考察，最終以乙腈-0.5%冰醋酸溶液梯度洗脫達(dá)到的效果最佳，本方法同時測定了柚皮苷和淫羊藿苷的含量，縮短了檢驗的時間，并對該色譜方法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)考察，建立了可行、簡便、準(zhǔn)確的含量測定方法。

目前院內(nèi)制劑質(zhì)量控制技術(shù)水平相對落后，大部分僅有定性鑒別方法，少數(shù)涉及含量測定，未能有效控制制劑產(chǎn)品的質(zhì)量，因此提高院內(nèi)制劑產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)成為迫在眉睫的任務(wù)。本課題通過對骨疏寧口服液中淫羊藿、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷和丹參藥材進(jìn)行定性鑒別，HPLC法測定淫羊藿苷和柚皮苷兩種黃酮類成分的含量，方法簡便，分離效果好，專屬性較強(qiáng)，為骨疏寧口服液多指標(biāo)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。