管內(nèi)硼親和固相微萃取-高效液相色譜全自動在線聯(lián)用檢測茶飲料中的順式二羥基化合物

王 欣, 何堅剛, 羅 琪, 劉 震

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 生命分析化學(xué)國家重點實驗室, 江蘇 南京 210023)

固相微萃取(solid phase microextraction, SPME)[1,2]是20世紀90年代興起的一項新穎的樣品前處理與富集技術(shù)。SPME技術(shù)自創(chuàng)立以來得到迅速發(fā)展與廣泛應(yīng)用[3-5]。SPME將樣品取樣、樣品制備和樣品濃縮等過程集成到一個萃取相并一步完成,能與分析儀器進行離線或在線聯(lián)用。絕大多數(shù)的SPME是利用非共價相互作用(如疏水相互作用等)將目標(biāo)分子吸附到萃取相表面,因而存在著作用力弱和選擇性較差的缺點。劉震等[6,7]發(fā)展出基于共價相互作用的固相微萃取----硼親和固相微萃取(BA-SPME)。取代硼酸在較高的pH條件下可以和順式二羥基分子結(jié)合,形成五元環(huán)或六元環(huán)的硼酸酯,而在較低的pH條件下,硼酸酯解離,釋放出順式二羥基分子[8,9]。因此,和常規(guī)的SPME相比,以取代硼酸為配基的硼親和SPME具有多種優(yōu)點:(1)選擇性較高,能選擇性萃取核苷酸、糖蛋白和糖肽等重要的順式二羥基生物分子;(2)作用力較強,解離平衡常數(shù)(Kd)通常為10-1～10-4mol/L,相對于非共價作用,萃取能力較強;(3)由于非共價作用導(dǎo)致的非特異性吸附可以通過重復(fù)清洗萃取相的辦法清除;(4)可以通過使用酸性pH或加入單糖等頂替試劑即可實現(xiàn)目標(biāo)物的解吸,不需要高溫、高鹽濃度、高有機溶劑等容易導(dǎo)致生物分子變性的苛刻條件。硼親和萃取技術(shù)已經(jīng)在核苷酸等生物小分子[10-15]、糖肽和糖蛋白等生物大分子[16-20]等的富集及分析中展現(xiàn)出強大優(yōu)勢。

SPME的一個重要優(yōu)勢是其易于與分析儀器進行聯(lián)用。但是,與SPME-GC聯(lián)用相比,SPME-HPLC聯(lián)用的實際應(yīng)用相對要少得多。這主要是因為SPME-HPLC聯(lián)用受以下兩個因素的限制:分析物在液相和常溫條件的解吸時間長,容易造成樣品殘留和樣品區(qū)帶展寬;自動化的SPME-HPLC聯(lián)用接口和聯(lián)用方法很少。硼親和固相微萃取的萃取/解吸為受pH調(diào)控的可逆過程,溶質(zhì)的解吸非常容易,采用弱酸性溶液洗脫即可。該特征使得硼親和固相微萃取特別適用于HPLC進行在線聯(lián)用。劉震等[7]已經(jīng)實現(xiàn)了管內(nèi)SPME-HPLC-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜的在線聯(lián)用。但目前,已報道的在線聯(lián)用尚不能進行反復(fù)多次的萃取/排除和自動進樣等自動化功能,BA-SPME與HPLC的自動化在線聯(lián)用還未見報道。

兒茶素和茶黃素是茶葉中重要的活性成分,它們均為順式二羥基化合物。兒茶素能有效地抑制或延緩中風(fēng)、衰老、癌癥和糖尿病的發(fā)生,而茶黃素具有調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防心血管疾病的功效,而且無毒副作用,被譽為茶葉中“軟黃金”[21-25]。因此,對茶葉及茶飲料中的兒茶素等順式二羥基化合物的自動分析與檢測對于茶葉及其制品的質(zhì)量控制具有重要意義。本文報道了一種新穎的管內(nèi)硼親和固相微萃取-高效液相色譜全自動在線聯(lián)用,用于分析茶飲料中的順式二羥基化合物。該自動化在線聯(lián)用方法利用商品化HPLC儀器配備的自動進樣器通過六通閥的切換實現(xiàn)流路連接。在本文中,制備了管內(nèi)硼親和SPME毛細管,考察了涂層柱的柱容量并對其形貌進行了表征,考察并優(yōu)化了影響實際樣品分離效果的因素,最后,利用該聯(lián)用方法對3種不同品牌的茶飲料進行了分析,并對沏茶溫度對茶水中順式二羥基化合物含量的影響進行了評價。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1200液相色譜儀(Agilent Technologies,德國)配備二極管陣列檢測器(DAD),液相色譜由LC 3D工作站(version B.02.01-SR1)控制。Venusil XBP-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm粒徑)購自Agela Technologies (Newark,美國)。熔融石英毛細管(75 μm i.d., 375 μm o.d.)購自河北銳灃色譜器件公司。

對乙烯基苯硼酸(VPBA)、間氨基苯硼酸單水化合物(m-PBA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)均為色譜純,購自美國Sigma公司。鄰苯二酚和對苯二酚均為色譜純,購自Alfa-Aesar天津公司。色譜純甲醇、乙腈均購自德國Darmstadt公司。偶氮二異丁腈(AIBN)、乙二醇、一縮二乙二醇、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉均為分析純,購自上海國藥化學(xué)試劑公司。AIBN使用前用甲醇重結(jié)晶。實驗用水由Milli-Q純水儀凈化所得。茶飲料均為無糖型,由超市購得,條形碼分別為:6925303721428(統(tǒng)一綠茶)、6920459998410(康師傅茉莉花茶)和6921581596048(三得利烏龍茶);溧陽綠茶(常州市六雨茶葉有限公司)。

圖 1 管內(nèi)硼親和固相微萃取-液相色譜自動在線聯(lián)用原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of automated on-line hyphenation of in-tube solid phase microextraction (SPME) with HPLC a. Extraction (Step 1): from the sample vial, the sample solution is repeatedly drawn into and ejected out of the in-tube SPME capillary; b. desorption and separation (Step 2): the in-tube SPME capillary is connected with the HPLC system.

1.2 實驗原理示意圖

管內(nèi)硼親和固相微萃取-高效液相色譜全自動在線聯(lián)用的原理見圖1。該在線聯(lián)用分為兩步:萃取,解吸和分離。在萃取時,萃取毛細管與自動進樣系統(tǒng)的計量泵相連,樣品反復(fù)多次從樣品瓶中被吸取到硼親和萃取毛細管并排出;在解吸和分離時,通過切換六通閥,硼親和萃取毛細管連接到液相色譜,被萃取到萃取毛細管管壁上的順式二羥基化合物用酸性流動相洗脫,然后直接注入HPLC系統(tǒng)進行分離和檢測。

1.3 硼親和涂層柱制備

硼親和涂層柱按照文獻[13]方法適當(dāng)修改后制作。首先進行毛細管管壁預(yù)處理:石英毛細管依次用1 mol/L NaOH溶液沖洗30 min,水沖洗至中性,1 mol/L HCl溶液沖洗30 min,水沖洗二次至中性,再用氮氣吹掃12 h至干。將γ-MAPS/MeOH(1∶1, v/v)溶液注入毛細管,在45 ℃水浴中反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇沖洗毛細管,氮氣吹干,得到內(nèi)壁衍生了雙鍵的毛細管空管。然后進行涂層柱的制備:1 mg AIBN溶于40 μL EDMA溶液中,加入20 mg VPBA,再加入195 μL一縮二乙二醇和45 μL乙二醇,渦旋,在冰浴中超聲15 min。將配好的溶液注入內(nèi)壁衍生了雙鍵的毛細管中,在75 ℃水浴中反應(yīng)2 h,用HPLC泵將未反應(yīng)完全的溶液泵出后在毛細管內(nèi)壁留下涂層,將制得的涂層柱用甲醇沖洗除去殘留的未反應(yīng)物。聚合反應(yīng)示意圖見圖2。涂層柱在使用前用100 mmol/L醋酸沖洗活化30 min。

圖 2 聚合反應(yīng)的原理圖Fig. 2 Schematic of the copolymerization reactionAIBN: 2,2′-azobis(2-methylpropionitrile).

1.4 色譜分離條件

色譜柱:Venusil XBP-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:20 ℃;流動相:甲醇/10 mmol/L甲酸(50∶50, v/v);流速:0.5 mL/min; DAD檢測波長:275 nm。

1.5 萃取參數(shù)設(shè)定

抽取/排出體積:40 μL;抽取/排出流速:300 μL/min;抽取/排出次數(shù):20次。

1.6 樣品制備

取適量茶飲料,加入等體積100 mmol/L磷酸二氫鈉后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH到8.5,加入偏亞硫酸鈉(6 mmol/L)防止兒茶素氧化,混勻后取適量進樣。

分別稱取1 g溧陽綠茶于3個茶杯中,依次用150 mL溫度為95、85、75和65 ℃的水加入杯中,加蓋泡30 min,之后分別取上清液與同體積的50 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液混合,之后加入偏亞硫酸鈉,用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH到8.5。將1.5 mL經(jīng)過處理的樣品放入樣品瓶中進行全自動SPME-HPLC測定。

圖 3 固相微萃取毛細管的掃描電鏡圖Fig. 3 Scanning electron microscope (SEM) images of the SPME capillary a. cross-sectional view of the capillary; b. enlarged image of the edge of the inner surface of the capillary.

2 結(jié)果與討論

2.1 涂層柱的表征

2.1.1萃取相表征

利用掃描電鏡(SEM)對poly(VPBA-co-EDMA)涂層毛細管的形貌進行表征。如圖3所示,在in-tube SPME毛細管內(nèi),已經(jīng)形成一層高分子涂層,厚度約1.68 μm。涂層表面非常粗糙,這有利于提高萃取相的萃取容量。

2.1.2萃取容量

利用前沿分析法,以鄰苯二酚和對苯二酚分別作為樣品和死時間標(biāo)記物,測定了柱容量。經(jīng)計算柱容量為6.6×10-6mol/L。

2.2 流動相流速選擇

圖 4 流速對茶飲料樣品中順式二羥基化合物的分離的影響Fig. 4 Effects of the flow rate of the mobile phase on the separation of cis-diol compounds extracted from tea beverage samples

本方法中,SPME萃取毛細管通過自動進樣器的流路與液相色譜的流路直接相連,由于自動進樣器流路無法承受太高流量和壓力,必須選擇合適的流速,以確保在流路壓力匹配的同時獲得良好的分離。若流速過大,不僅可能造成流路漏液,而且導(dǎo)致分離不足;而若流速太慢,則分離時間過長,峰展寬明顯。因此,考察了流速對于樣品分離的影響。選用康師傅茉莉花茶作為樣品,在不接入SPME并在相同進樣量的條件下,依次考察了0.5、0.4、0.3和0.2 mL/min 4個流速條件下的分離情況。由圖4可知,隨著流速的降低,整體分離效果有所改善,分離得到的組分數(shù)目逐漸增加;但就分離時間而言,0.2 mL/min流速下的分離時間是0.5 mL/min流速下的2倍。綜合分離效果和分離速度上的考慮,仍選擇0.5 mL/min做進一步的考察。根據(jù)硼親和色譜機理[26-28],樣品中的非順式二羥基化合物不被管內(nèi)硼親和SPME柱富集,被富集并轉(zhuǎn)移到分離柱上的組分主要為順式二羥基化合物。

圖 5 有無固相微萃取時的HPLC色譜圖對比Fig. 5 Comparison of the HPLC chromatograms with and without SPME

2.3 萃取能力及聯(lián)用性能考察

選擇三得利烏龍茶飲料作為考察對象,在全自動抽取/排出情況下,考察了in-tube BA-SPME對實際樣品的選擇性萃取能力。由圖5可知,在選擇抽取排出體積、速度和次數(shù)分別為40 μL、300 μL/min和20次的情況下,經(jīng)in-tube BA-SPME萃取后的譜圖中檢測到的色譜峰個數(shù)增加,而且峰的強度普遍增加。以和其他色譜峰基線分離的最后一個峰比較,通過SPME進行樣品處理后,峰高增加了2.1倍。以上結(jié)果說明采用該管內(nèi)硼親和SPME的必要性及該聯(lián)用系統(tǒng)的有效性。

2.4 實際樣品分析

進一步考察了in-tube BA-SPME對于3種茶飲料的萃取及分離能力。由圖6可知,3種茶飲料的色譜圖輪廓大致相同,說明所含的兒茶素等順式二羥基成分大致相同,但各色譜峰的信號強度不盡相同,說明兒茶素等順式二羥基成分含量不同。

圖 6 不同茶飲料樣品的色譜對比圖Fig. 6 Comparison of the chromatograms for different tea beverages

圖 7 沏茶溫度對茶水中順式二羥基化合物的影響Fig. 7 Effects of tea-making temperature on the profile of cis-diol compounds in tea

2.5 沏茶溫度的影響

選用溧陽綠茶作為考察對象,以燒開后不同溫度的自來水來考察沏茶溫度對于茶水質(zhì)量的影響,以茶水中順式二羥基成分的含量作為評判標(biāo)準。圖7顯示了不同沏茶水溫下茶水的色譜圖。在65～85 ℃范圍內(nèi),茶水中的順式二羥基化合物的濃度隨著溫度升高而增加,但溫度進一步升高到95 ℃時,譜圖中順式二羥基化合物的峰高反而降低。這說明,較高的溫度有利于將兒茶素等活性成分從茶葉中浸提到水中,但溫度過高時,兒茶素等順式二羥基化合物可能發(fā)生氧化,兒茶素等活性成分的濃度反而降低。因此,從最大限度地獲得兒茶素等活性成分的角度考慮,沏茶存在一個最佳的溫度(本文條件下為85 ℃)。

3 結(jié)論

以硼親和高分子涂層毛細管柱作為管內(nèi)固相微萃取柱,以商品化和自制茶飲料中的順式二羥基化合物為目標(biāo)分析物,通過對自動進樣系統(tǒng)的流路進行簡單改動,成功建立了硼親和SPME與HPLC的自動化在線聯(lián)用。該在線聯(lián)用方法能明顯提高對實際樣品中的順式二羥基化合物的檢測靈敏度。由于整個萃取和分離過程由計算機自動控制,該聯(lián)用系統(tǒng)能提供良好的萃取和分離重現(xiàn)性。利用該系統(tǒng)所得的色譜圖能在一定程度上體現(xiàn)不同茶飲料中的順式二羥基組分的濃度差異。此外,對沏茶溫度的考察顯示,為獲得最大量的兒茶素等順式二羥基化合物成分,存在一個最佳的沏茶溫度。