茯磚茶中冠突散囊菌的分離鑒定及其發(fā)酵工藝和生物活性研究

張?jiān)?，崔旋旋，劉英學(xué)，蓋永強(qiáng)，樸美子*

1(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266109)2(青島中一監(jiān)測(cè)有限公司，山東 青島，266100)

茯磚茶，又稱茯茶、福磚，是我國(guó)特有的一種黑茶品種，從外觀看呈長(zhǎng)方磚形，色澤黑褐油潤(rùn)，花香濃郁純正，因其藥效類似土茯苓，故又得名“茯磚”[1]。茯磚茶內(nèi)部長(zhǎng)有大量金黃色顆粒物質(zhì)，俗稱為“金花”[2]。茯磚茶發(fā)花的本質(zhì)就是利用溫度、濕度等外部條件加快益生菌——冠突散囊菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)抑制其他菌落的生長(zhǎng)，形成金黃色閉囊殼——金花，這是茯磚茶獨(dú)特品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序，也是其區(qū)別于其他黑茶制作的獨(dú)特工序[3]，使茯磚茶具有特有的菌落花香，使其滋味更加醇和清香[4-5]。

研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌具有抗氧化[6-7]、抑菌[7-8]、降脂[9-10]、產(chǎn)酶[11-12]等活性，受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。SALAZAR等[13]的研究結(jié)果表明冠突散囊菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，可能對(duì)抗腫瘤具有一定功效。李佳蓮等[14]發(fā)現(xiàn)“金花菌”發(fā)酵液對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用且對(duì)一定的溫度、紫外光和酸堿穩(wěn)定。唐萬(wàn)達(dá)等[15]的研究結(jié)果表示，涇陽(yáng)茯磚茶具有抗氧化酶活性且其與茶磚發(fā)花期產(chǎn)生的赤散囊菌有關(guān)。歐陽(yáng)梅等[16]將“金花菌”接種到散茶中并測(cè)定發(fā)酵散茶的抗氧化活性，結(jié)果顯示，發(fā)酵散茶的抗氧化活性較散茶有一定提高，表明“金花菌”具有抗氧化活性。先前對(duì)冠突散囊菌的研究，主要集中在對(duì)茶葉固態(tài)發(fā)酵風(fēng)味形成的影響以及菌種與其他原料共同發(fā)酵的功能活性，對(duì)純菌種發(fā)酵條件及活性研究較少，這也限制了基于冠突散囊菌的生產(chǎn)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯磚茶，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中韓食品生物技術(shù)研究所提供；馬鈴薯，購(gòu)于青島大潤(rùn)發(fā)春陽(yáng)路店。

大腸桿菌1.873 2(Escherichiacoli)、腸沙門氏菌1.107 54(Salmonellaenterica)、枯草芽孢桿菌1.425 5(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌1.107 12(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌1.872 1(Staphylococcusaureus)，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中韓食品生物技術(shù)研究所提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(patato dextrose agar，PDA)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖水(potato dextrose，PD)，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；DPPH·、三羥甲基氨基甲烷(Tris),美國(guó)Sigma公司；鄰苯三酚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)，Solarbio公司；鄰二氮菲、鐵氰化鉀，天津廣成化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9032電熱恒溫培養(yǎng)箱，中國(guó)龍口市先科儀器有限公司；IS-RDV3立式恒溫振蕩器，美國(guó)精騏有限公司；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；YXQ-LS-SII高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DU-800型紫外分光光度計(jì)，美國(guó)貝克曼公司；RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茯磚茶中冠突散囊菌的分離及鑒定

1.3.1.1 菌株的分離、純化

無(wú)菌條件下，直接挑取茯磚茶上的金花閉囊殼，接種于PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，待菌落生長(zhǎng)成黃色時(shí)，用無(wú)菌接種環(huán)挑取適量菌體進(jìn)行平板劃線，多次劃線直到菌株初步純化。挑取平板上的金黃色單菌落，接種到PDA平板上，繼續(xù)培養(yǎng)直至菌落生長(zhǎng)成黃色，得到目標(biāo)菌株。挑取適量目標(biāo)菌株的黃色閉囊殼至裝有100 mL無(wú)菌蒸餾水與玻璃珠的錐形瓶中，制成均勻的菌懸液，并進(jìn)行10倍梯度稀釋。取10-3～10-6稀釋度的菌懸液200 μL分別涂布到PDA培養(yǎng)基上，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)3 d。選取長(zhǎng)有單菌落的平板，得到的菌落即為目標(biāo)單菌落，觀察菌落形態(tài)，并用顯微鏡觀察個(gè)體形態(tài)特征。

1.3.1.2 分離菌株的鑒定

將分離純化后的菌株接種至PDA培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)3 d，從培養(yǎng)皿中刮取菌絲，采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB)法提取真菌DNA，采用引物ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reation，PCR)擴(kuò)增體系為：DNA模板1.0 μL；10×Buffer(含2.5 mmol/L Mg2+)，5.0 μL；Taq聚合酶 1.0 μL；脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)(10 mmol/L)，1.0 μL；ITS1引物1.5 μL；ITS4引物1.5 μL；ddH2O 39.0 μL；總體積50.0 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性，95 ℃，5 min；變性，95 ℃，30 s；退火，58 ℃，30 s；延伸，72 ℃，1 min；終延伸，72 ℃，7 min；35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)處理后送往上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序獲得的ITS基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中使用Blast進(jìn)行比對(duì)。

1.3.2 GT-1菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化

以GT-1菌株發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH·的清除能力為指標(biāo)，確定該菌株的最佳發(fā)酵工藝。

1.3.2.1 GT-1菌株發(fā)酵液提取物的制備

將分離的單菌落接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～6 d，待斜面菌落由白色變?yōu)榈S色再變?yōu)榛液稚笳f(shuō)明孢子成熟。用生理鹽水沖洗斜面制備孢子懸液，使其孢子濃度為1×108CFU/mL。取適量GT-1菌株孢子懸液接入滅菌后的PD中于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中25 ℃，160 r/min培養(yǎng)9 d，得到GT-1菌株發(fā)酵液。

發(fā)酵液過(guò)濾菌絲體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/10，加入3倍體積的無(wú)水乙醇，醇沉12 h后5 000 r/min離心10 min，取上清液旋蒸并冷凍干燥，得到GT-1菌株發(fā)酵液提取物。

1.3.2.2 GT-1菌株發(fā)酵液提取物清除DPPH·活性測(cè)定

將GT-1菌株發(fā)酵液提取物凍干粉配制成2.5 mg/mL的溶液，采用BOUGATEF等[17]的方法測(cè)定其對(duì)DPPH·的清除率。

1.3.2.3 GT-1菌株發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

(1)碳源對(duì)發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響

在原有PD液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別改變其中的碳源為蔗糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖、乳糖，在40%裝液量、2%接種量，160 r/min，25 ℃條件下發(fā)酵9 d，比較發(fā)酵液提取物清除DPPH·活性的差異。

(2)氮源對(duì)發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響

在原有PD液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別改變其中的氮源為NaNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、酵母膏、蛋白胨，在40%裝液量、2%接種量，160 r/min，25 ℃條件下發(fā)酵9 d，比較發(fā)酵液提取物清除DPPH·活性的差異。

(3)發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響

裝液量40%、接種量3%，160 r/min，25 ℃，分別發(fā)酵3、6、9、12、15 d，比較不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液提取物清除DPPH·的活性。

(4)裝液量對(duì)發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響

分別以10%、20%、30%、40%、50%的裝液量，3%的接種量條件接種，于160 r/min，25 ℃條件下培養(yǎng)9 d，比較發(fā)酵液提取物清除DPPH·活性的差異。

(5)接種量對(duì)發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響

分別以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的接種量，40%的裝液量，于160 r/min，25 ℃條件下培養(yǎng)9 d，比較發(fā)酵液提取物清除DPPH·活性的差異。

1.3.2.4 GT-1菌株發(fā)酵條件正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9(33)正交試驗(yàn)，以發(fā)酵時(shí)間、裝液量、接種量3個(gè)因素為影響因素，以清除DPPH·的能力為指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行正交優(yōu)化，因素水平見(jiàn)表1。

表1 L9(33)正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels in L9(33) orthogonal experiment design

1.3.3 GT-1菌株發(fā)酵液提取物抗氧化活性研究

通過(guò)正交試驗(yàn)得到GT-1菌株的最佳發(fā)酵條件，研究此條件下發(fā)酵液提取物的抗氧化活性。

(1)GT-1菌株發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定采用BOUGATEF等[17]的方法，由清除率曲線擬合回歸曲線，并計(jì)算樣品清除DPPH·的IC50值。

(3)GT-1菌株發(fā)酵液提取物還原能力的測(cè)定采用鐵氰化鉀還原測(cè)定法[19]。

1.3.4 GT-1菌株發(fā)酵液提取物抑菌活性研究

將供試菌株活化后制備成菌濃度為106～108CFU/mL的菌懸液，以50 μg/mL青霉素為陽(yáng)性對(duì)照，采用打孔法[20]對(duì)不同濃度發(fā)酵液提取物的抑菌活性進(jìn)行研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化及鑒定結(jié)果

2.1.1 菌株的分離純化及形態(tài)特征

圖1為分離菌株在PDA培養(yǎng)基平板中的菌落特征，可以看出菌株是邊緣較為整齊的圓形菌落。培養(yǎng)初期，菌落為白色菌絲，3 d后菌落慢慢變?yōu)榈S色。最終成熟后菌落的邊緣為淡黃色，越往內(nèi)部顏色越深，中心部位為褐色。菌落背面無(wú)脊無(wú)褶，呈深褐色。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of bacterial colonies

由圖2可知，分離菌株菌落由菌絲體及子囊果構(gòu)成，子囊果呈球形，這與已發(fā)現(xiàn)的散囊菌的菌絲體及子囊果的形態(tài)結(jié)構(gòu)非常相似[21]，內(nèi)部具有許多小的子囊孢子和分生孢子，孢子外壁較粗糙，有刺狀突起。

a-分離菌株子囊果;b-分離菌株菌絲體圖2 分離菌株菌絲體及子囊果Fig.2 Mycelia and ascospores of isolated strains

2.1.2 菌株分子鑒定結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后菌株的ITS區(qū)序列電泳結(jié)果如圖3所示。由電泳結(jié)果可知，擴(kuò)增的菌株ITS區(qū)序列片段長(zhǎng)度約為550 bp。經(jīng)上海生工測(cè)序后的結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明該序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中Eurotiumcristatumstrain IT1824259(Sequence ID：KR812327.1)的相似度為99.57%，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖4。綜合形態(tài)學(xué)和分子鑒定結(jié)果，鑒定該菌為冠突散囊菌，命名為Eurotialessp.GT-1。

圖3 ITS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR amplification product of ITS gene

圖4 分離菌株Blast比對(duì)結(jié)果圖Fig.4 Result of Blast comparison of isolated strain

2.2 GT-1菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 GT-1菌株發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

GT-1菌株發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5-a可知，當(dāng)GT-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為麥芽糖時(shí)，所得發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH·清除率為93.1%，顯著高于(P<0.05)其他組，故采用麥芽糖作為該菌株發(fā)酵的最佳碳源；由圖5-b可知，當(dāng)GT-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源為酵母膏時(shí)，所得發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH·清除率為95.3%，顯著高于(P<0.05)其他組，故采用酵母膏作為該菌株發(fā)酵的最佳氮源；由圖5-c可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為9 d時(shí)，所得發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH·清除率為90.9%，顯著高于(P<0.05)其他發(fā)酵時(shí)間；由圖5-d可知，當(dāng)裝液量為10%時(shí)，所得發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH·清除率為90.8%，顯著高于(P<0.05)其他裝液量；由圖5-e可知，當(dāng)接種量為2%時(shí)，所得發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH·清除率為90%，顯著高于(P<0.05)其他接種量。

2.2.2 GT-1菌株發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，3個(gè)單因素中，對(duì)菌株發(fā)酵液提取物DPPH·清除率影響順序?yàn)檠b液量>接種量>發(fā)酵時(shí)間，最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間9 d、裝液量13%、接種量2.2%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Results of the orthogonal experiment

a-碳源對(duì)發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響;b-氮源對(duì)發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響;c-發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響;d-裝液量對(duì)發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響;e-接種量對(duì)發(fā)酵液提取物DPPH·清除率的影響圖5 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 The results of single factor experiment注：圖中不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05(下同)

在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到GT-1菌株發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH·的清除率達(dá)(93.9±1.12)%。

2.3 GT-1菌株發(fā)酵液提取物抗氧化活性研究

2.3.1 不同濃度GT-1菌株發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH·的清除能力

如圖6所示，發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH·的清除率隨著濃度增加而升高。當(dāng)提取物的質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，其DPPH·清除率達(dá)到了93.9%，顯著高于(P<0.05)其他濃度，其IC50值為0.78 mg/mL。由此可知，GT-1菌株發(fā)酵液提取物具有較好的清除DPPH·的活性，與顏正飛等[22]的結(jié)論一致。

圖6 發(fā)酵液提取物濃度對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.6 Effect of extract concentration of fermentation broth on DPPH free radical scavenging rate

圖7 發(fā)酵液提取物濃度對(duì)清除率的影響Fig.7 Effect of extract concentration of fermentation broth on free radical scavenging rate

2.3.3 不同濃度GT-1菌株發(fā)酵液提取物還原能力的測(cè)定

如圖8所示，發(fā)酵液提取物具有很強(qiáng)的還原性，隨提取物濃度增大還原力增強(qiáng)。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)，其還原力為0.98。

圖8 發(fā)酵液提取物濃度對(duì)還原能力的影響Fig.8 Effect of extract concentration of fermentation broth on reducing power

綜上所述，GT-1菌株發(fā)酵液具有較好的抗氧化活性，這可能與其菌體孢子壁質(zhì)地堅(jiān)硬可抗腐蝕且自身具備一定自由基清除能力有關(guān)。另外，其在發(fā)酵過(guò)程中可能產(chǎn)生過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等具有抗氧化活性的酶類及苯甲醛類、多酚類代謝產(chǎn)物也是其具有較強(qiáng)的抗氧化活性的原因之一[7,15,22-24]。

2.4 GT-1菌株發(fā)酵液提取物抑菌活性研究

如表3所示，GT-1菌株發(fā)酵液提取物對(duì)大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌及腸沙門氏菌均具有一定的抑菌效果，且隨發(fā)酵液提取物濃度的增加而有顯著性增強(qiáng)(P<0.05)，這可能與其發(fā)酵液中含有大黃素蒽醌類、苯甲醛類、酚類和苯甲酸類這4種具有良好抑菌效果的化合物密切相關(guān)[7]。

表3 發(fā)酵液提取物濃度對(duì)抑菌活性的影響Table 3 Effect of extract concentration of fermentation broth on antimicrobial activity

3 結(jié)論