克雷伯氏菌發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)丁二酸的代謝特性

劉攀攀，崔志勇，王子坤，張琴,3*

1(塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾，843300)2(塔里木大學(xué)，分析測試中心，新疆 阿拉爾，843300) 3(塔里木大學(xué)，塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾，843300)

丁二酸(succinic acid，SA)是三羧酸循環(huán)中重要的中間代謝產(chǎn)物，也是C4平臺重要的化合物，它作為一種重要的有機(jī)化工原料，可用于合成1,4-丁二醇、四氫呋喃、丁內(nèi)酯、α-吡喏烷酮(α-pyrrolidone，NKP)、N-甲基吡咯烷酮及可降解生物高分子材料聚丁二酸丁二醇酯(polybutylene succiante,PBS)等原料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日化、紡織、農(nóng)業(yè)、塑料等工業(yè)領(lǐng)域[1-2]。同時，丁二酸也是最重要的積木化學(xué)品之一，2004年被美國能源部認(rèn)定為未來12種潛在的生物基化學(xué)品之一[3-8]。由于其多樣化的應(yīng)用，全球丁二酸市場迅速增長，于建榮等[9]預(yù)計(jì)2020年丁二酸的產(chǎn)量達(dá)7～8萬t，市場價值將達(dá)到5.4億美元。近年來，隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸因具資源可再生利用等優(yōu)勢，有較大的發(fā)展?jié)摿10]。較多微生物菌種都可通過一定代謝途徑合成丁二酸，原核微生物中，丁二酸合成的代謝途徑主要有3條：(1)從三羧酸循環(huán)的還原性支路合成，在該途徑中，丁二酸從磷酸烯醇式丙酮酸起始經(jīng)由一些中間代謝物包括草酰乙酸、蘋果酸和富馬酸的轉(zhuǎn)化而合成；(2)從乙醛酸循環(huán)途徑合成，該途徑中，2 mol乙酰CoA轉(zhuǎn)化合成1 mol丁二酸；(3)從氧化三羧酸循環(huán)合成，該途徑從乙酰CoA的轉(zhuǎn)化開始，依次轉(zhuǎn)化為檸檬酸、異檸檬酸、丁二酸，合成的丁二酸再在丁二酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為富馬酸[11]。為此，代謝產(chǎn)物的監(jiān)測可在一定程度上弄清微生物合成丁二酸的代謝途徑。

克雷伯氏菌是工業(yè)生產(chǎn)中重要的發(fā)酵菌種，用于多種生物基化學(xué)品如1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙醇、生物氫等的發(fā)酵生產(chǎn)中。并且，克雷伯氏菌還有較廣的基質(zhì)利用特性，尤其是有的野生菌株能利用木質(zhì)纖維素水解液進(jìn)行生物基化學(xué)品的發(fā)酵生產(chǎn)，如CHENG等[12]報道了1株Klebsiellaoxytoca能夠發(fā)酵玉米芯酸解液生產(chǎn)2,3-丁二醇，JIANG等[13]報道了1株Klebsiellaoxytoca能夠發(fā)酵麻風(fēng)樹皮酸解液生產(chǎn)2,3-丁二醇。在克雷伯氏菌中，丁二酸是伴隨一些生物基化學(xué)品產(chǎn)生的重要代謝物，CHENG等[14]報道了pH值和溶解CO2水平對Klebsiellapneumonia中2,3-丁二醇和丁二酸產(chǎn)量的影響。然而，迄今，較少研究涉及克雷伯氏菌用于生物丁二酸的生產(chǎn)。

棉稈是新疆廣泛存在的生物質(zhì)原料，近年來棉稈的高值化利用備受關(guān)注，棉稈高值化產(chǎn)品的開發(fā)也呈現(xiàn)多樣化。在棉稈轉(zhuǎn)化生產(chǎn)丁二酸的研究中，有學(xué)者報道了采用產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵纖維素酶處理的棉稈纖維用于丁二酸的生產(chǎn)[15-16]，然而，關(guān)于微生物共利用棉稈水解糖液中的葡萄糖和木糖生產(chǎn)丁二酸的研究尚未見報道。本課題組在前期研究工作中已分離獲得7株克雷伯氏菌，本研究旨在通過對這些菌株發(fā)酵棉稈水解糖液過程中丁二酸產(chǎn)量及其關(guān)鍵酶和代謝產(chǎn)物的監(jiān)測和分析，明晰菌株發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

由本課題組分離獲得并保藏于塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的7株克雷伯氏菌，編號分別為WL1305、WL1316、WL1309、WL1312、WL1307、WL1306、WL1315。

1.1.2 原料

新疆阿拉爾市棉田中的棉花秸稈，風(fēng)干、粉碎后過20目篩備用。

1.1.3 試劑

丁二酸檢測試劑盒、丙酮酸檢測試劑盒、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒、琥珀酸脫氫酶檢測試劑盒、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)試劑、地衣酚試劑等,上海譽(yù)譜化工科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基的制備

斜面活化培養(yǎng)基(g/L)：木糖10，葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 1，瓊脂22，pH 7.0，水1 L，110 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：木糖10，葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 1，pH 7.0，水1 L，110 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 1，pH 7.0，棉稈的酸解糖液1 L，110 ℃滅菌30 min。棉稈水解糖液初始糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵棉稈酸解糖液的制備

采用實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的酸解方法[17]制備棉稈酸解液：配制體積分?jǐn)?shù)為4%的稀H2SO4，調(diào)節(jié)固液比為1∶5(g ∶mL)，于121 ℃，103 kPa高溫高壓下水解30 min，抽濾獲得棉稈酸解液。

獲得的酸解液放置于室溫，調(diào)節(jié)pH值至10.0，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，用稀H2SO4回調(diào)至pH=5.0，實(shí)現(xiàn)其脫毒。所得糖液經(jīng)脫毒脫色大孔樹脂過濾，即得酸解糖液。

1.2.2 菌株活化、種子制備及發(fā)酵培養(yǎng)

斜面活化的菌種，接種于活化培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)12～16 h，調(diào)節(jié)OD600約為1.0，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)。分別于6、12、18、24、30、36 h取樣、離心，分別收集上清液和細(xì)菌細(xì)胞，用于測定丁二酸及其關(guān)鍵酶和代謝產(chǎn)物。

1.2.3 克雷伯氏菌發(fā)酵棉稈水解糖液還原糖及丁二酸測定

葡萄糖含量采用DNS比色法測定[18],木糖含量采用地衣酚試劑比色法測定[19],丁二酸含量采用丁二酸試劑盒測定;乳酸含量通過乳酸含量試劑盒檢測；丙酮酸含量通過丙酮酸含量測定試劑盒檢測；琥珀酸脫氫酶活性通過琥珀酸脫氫酶試劑盒檢測；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶試劑盒檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁二酸產(chǎn)量及還原糖利用率的結(jié)果分析

檢測了7株克雷伯氏菌在發(fā)酵6、12、18、24、30和36 h的丁二酸含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 七株細(xì)菌發(fā)酵液中的丁二酸含量Fig.1 Succinic acid content of the seven strains in the fermentation broth

由圖1可知，7株克雷伯氏菌在6～36 h均能有效發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)丁二酸。其中，菌株WL1309和WL1312在發(fā)酵早期(6 h)即獲得了較高的丁二酸產(chǎn)量，此時的丁二酸含量均達(dá)42 g/L以上，之后丁二酸產(chǎn)量有一定降低。其余5株細(xì)菌在發(fā)酵12 h的丁二酸含量均達(dá)峰值，表明了這些菌株在較早期(12 h)產(chǎn)丁二酸的特性，可見這7株克雷伯氏菌在發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的時間集中于6～12 h，為此，可初步推測，這些菌株可能通過還原性三羧酸循環(huán)途徑產(chǎn)丁二酸。在發(fā)酵18～36 h，大多數(shù)菌株所產(chǎn)丁二酸均有一定降低(WL1307除外)，大多數(shù)低于20 g/L，有的甚至低于10 g/L，可推測，這些菌株所產(chǎn)丁二酸可能在三羧酸循環(huán)途徑中較多地轉(zhuǎn)化，為此，調(diào)控發(fā)酵時間對于高產(chǎn)量丁二酸的獲得至關(guān)重要。

這7株克雷伯氏菌在發(fā)酵過程均能有效利用棉稈水解糖液中的葡萄糖和木糖。由圖2可知，至發(fā)酵結(jié)束(36 h)，這7株菌已利用了棉稈水解糖液中大多數(shù)的葡萄糖和木糖，其葡萄糖利用率均高于85%，木糖利用率均高于90%，由此可見，這些菌株對棉稈水解糖液中葡萄糖和木糖的利用能力均較高。

圖2 七株細(xì)菌發(fā)酵結(jié)束的還原糖利用率Fig.2 Utilization rate of reducing sugar at the end of fermentation of seven bacria

2.2 克雷伯氏菌發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)丁二酸過程中關(guān)鍵酶活性分析

2.2.1 琥珀酸脫氫酶活性的結(jié)果分析

琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)是檸檬酸循環(huán)中唯一與膜結(jié)合的不溶性酶，也是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一，琥珀酸在琥珀酸脫氫酶的作用下被氧化生成延胡索酸，因此，作為一種直接作用于琥珀酸的不可逆性酶，它的活性高低直接影響合成丁二酸的含量[20]。

由圖3可知，7種克雷伯氏菌在6～36 h的琥珀酸脫氫酶均有一定的活性，但相對較低，都在0～0.005 5 nmol/(min·104cell)，其中，WL1305、WL1316、WL1309在6～36 h時發(fā)酵過程中均有一定的峰值，說明該酶在某一時間段均有促進(jìn)丁二酸轉(zhuǎn)化為延胡索酸的能力，不利于丁二酸的積累，因此，需嚴(yán)格控制發(fā)酵時間，減少發(fā)酵過程中丁二酸的轉(zhuǎn)化。而WL1312、WL1307、WL1306、WL1315在6～36 h整個發(fā)酵時間段酶的活性均較低，顯示其對菌株發(fā)酵過程中丁二酸的產(chǎn)量影響較小。

圖3 七株菌發(fā)酵產(chǎn)丁二酸過程中的琥珀酸脫氫酶活性Fig.3 Succinic acid dehydrogenase activity during fermentation of succinic acid by seven strains

2.2.2 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性結(jié)果分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，Pepck)是丁二酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，與CO2反應(yīng)生成草酰乙酸呈不可逆反應(yīng)的酶。它的活性直接影響磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,Pep)與草酰乙酸之間代謝流的暢通，從而影響產(chǎn)丁二酸的含量[21]。

結(jié)合圖3、圖4可知，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于琥珀酸脫氫酶的活性，其中，7株菌在24～36 h 活性有顯著增加的趨勢，說明在這一時間段該酶有利于磷酸烯醇式丙酮酸脫羧形成草酰乙酸，但這一時間段7株菌(WL1307除外)產(chǎn)丁二酸的能力均下降，推斷可能是因?yàn)榱姿嵯┐际奖峤?jīng)過磷酸烯醇式丙酮酸脫羧酶作用下形成草酰乙酸后，促進(jìn)了三羧酸循環(huán)的進(jìn)行，競爭了還原性三羧酸循環(huán)生成丁二酸。

圖4 七株菌發(fā)酵產(chǎn)丁二酸過程中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性Fig.4 Phosphoenolpyruvate carboxylase activity during fermentation of succinic acid by seven strains

2.3 克雷伯氏菌發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)丁二酸過程中主要代謝產(chǎn)物分析

2.3.1 菌株細(xì)胞內(nèi)外丙酮酸濃度分析

丙酮酸是聯(lián)系細(xì)胞代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)化合物。由圖5-a可知，7株細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸含量在發(fā)酵36 h內(nèi)均較低，大多數(shù)菌株在12～18 h達(dá)到一個峰值，之后有一定降低，最后有一定升高，表明丙酮酸節(jié)點(diǎn)處的代謝流分布受諸多代謝途徑的影響，隨著時間的增加有明顯升高的趨勢，在36 h時含量較高，都高于1.1 μg/104cell，表明克雷伯氏菌在這一點(diǎn)是利用棉稈水解液進(jìn)行糖酵解產(chǎn)丙酮酸的關(guān)鍵時間點(diǎn)，更有利于進(jìn)行三羧酸循環(huán)從而轉(zhuǎn)向丁二酸，而在0～30 h丙酮酸的濃度總體偏低，說明在此期間還原糖通過其他途徑進(jìn)行代謝產(chǎn)丁二酸，從而降低了丙酮酸的濃度。由圖5-b可知，7株克雷伯氏菌細(xì)胞外的丙酮酸含量從總體來看均較高，高于80 mg/L，并且隨著時間的增加呈梯度緩慢上升，至發(fā)酵后期(30～36 h)，其含量已達(dá)140 mg/L以上。因此，丙酮酸作為還原性三羧酸循環(huán)中丁二酸合成的競爭代謝產(chǎn)物及氧化性三羧酸循環(huán)中丁二酸合成和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵化合物，其高濃度在發(fā)酵早期(6～12 h)可能開始競爭丁二酸合成支路的代謝流分布，而在發(fā)酵的中后期(24～36 h)，使得較多的代謝流分布于氧化性三羧酸循環(huán)，這時丁二酸有一定積累，但仍在加速轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致丁二酸的濃度并不會太高，甚至有降低的趨勢。

a-胞內(nèi)丙酮酸濃度；b-胞外丙酮酸濃度圖5 七株菌發(fā)酵產(chǎn)丁二酸過程中的胞內(nèi)外丙酮酸濃度Fig.5 Intracellular and extracellular pyruvate concentration during fermentation of succinic acid by seven strains

2.3.2 細(xì)胞內(nèi)外乳酸濃度的分析

由圖6-a可知，7株細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的乳酸濃度在全發(fā)酵周期內(nèi)非常低，尤其在6～12 h與24～36 h兩個時間段，7株細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)乳酸濃度幾乎接近0，而在12～24 h出現(xiàn)一個峰值，由此表明，盡管菌株細(xì)胞內(nèi)乳酸含量極低，但在發(fā)酵12～24 h仍有一定積累。由圖6-b可知，7株克雷伯氏菌的胞外乳酸含量從整體來看仍然不高，除WL1315以外，其余6株細(xì)菌細(xì)胞外的乳酸濃度都在0～15 mmol/L，只是在發(fā)酵過程中有一定的積累，處理一定峰值(WL1309、WL1307和WL1315有2個峰值)。從這些菌株胞內(nèi)外乳酸濃度來看，總體都不高，表明乳酸發(fā)酵途徑在發(fā)酵0～36 h，對丁二酸的競爭作用并不算太強(qiáng)，對丁二酸合成支路代謝流分布的競爭作用相對較弱。

a-胞內(nèi)乳酸濃度；b-胞外乳酸濃度圖6 七株菌發(fā)酵產(chǎn)丁二酸過程中的胞內(nèi)外乳酸濃度Fig.6 Intracellular and extracellular lactic acid concentration during fermentation of succinic acid by seven strains

3 結(jié)論

本文研究了克雷伯氏菌發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)丁二酸代謝的特性，通過對菌株發(fā)酵過程中丁二酸含量、葡萄糖和木糖利用率、丙酮酸含量、乳酸含量及關(guān)鍵酶活性的測定、利用及分析，弄清了這些克雷伯氏菌發(fā)酵棉稈產(chǎn)丁二酸的主要代謝途徑及其競爭代謝支路。獲得的結(jié)論如下：

(1)7株克雷伯氏菌在6～36 h均能有效發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)丁二酸，且其在發(fā)酵早期(6～12 h)獲得的丁二酸產(chǎn)量最高，在發(fā)酵過程中能有效利用棉稈水解糖液中葡萄糖和木糖，至發(fā)酵結(jié)束(36 h)，這7株菌的葡萄糖利用率均高于85%，木糖利用率均高于90%。

(2)7株克雷伯氏菌在發(fā)酵產(chǎn)丁二酸過程中，琥珀酸脫氫酶活性均較低，而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性較高，并且在發(fā)酵6～12 h及24～36 h對丁二酸合成的影響較強(qiáng)，表明其在發(fā)酵早期(6～12 h)可能促進(jìn)了丁二酸在還原性三羧酸循環(huán)途徑的合成，而在發(fā)酵后期(24～36 h)，因其產(chǎn)物(草酰乙酸)的消耗，加之丙酮酸節(jié)點(diǎn)高的代謝流分布，則加速了丁二酸的轉(zhuǎn)化。

(3)7株克雷伯氏菌細(xì)胞外發(fā)酵液的丙酮酸含量從總體來看均較高，尤其在發(fā)酵后期其質(zhì)量濃度已達(dá)140 mg/L以上，從其濃度變化可推測，丙酮酸節(jié)點(diǎn)可能在發(fā)酵中后期(24～36 h)加速了丁二酸的轉(zhuǎn)化，引起丁二酸合成支路代謝流分布的降低。相較而言，7株細(xì)菌胞內(nèi)外乳酸濃度在發(fā)酵過程中均不高，只是在一定發(fā)酵階段有一點(diǎn)積累，但其對丁二酸合成支路代謝流分布的影響仍較弱。

4 討論

丁二酸是許多厭氧和兼性厭氧微生物的發(fā)酵終產(chǎn)物之一。目前研究的工業(yè)菌株主要有厭氧的谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)[22]和厭氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)[23]、兼性厭氧放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)[24]和大腸桿菌(Escherichiacoli)[25]。其發(fā)酵方式分為兩種：(1)好氧發(fā)酵。在有氧的狀況下，菌株具有較快的生長和代謝速率，但到菌株穩(wěn)定期發(fā)酵時由于溶氧不足會使產(chǎn)酸速率降低及副產(chǎn)物增加；(2)厭氧發(fā)酵。發(fā)酵需絕對厭氧，條件較為苛刻，碳源利用緩慢，發(fā)酵周期較長，但丁二酸轉(zhuǎn)化速率高。本研究采用兼性厭氧菌—克雷伯氏菌進(jìn)行發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)丁二酸的整個過程中，發(fā)現(xiàn)丁二酸含量在發(fā)酵前期較高，到后期有所降低，根據(jù)關(guān)鍵酶及發(fā)酵產(chǎn)物的變化，推測原因是發(fā)酵前期沒有代謝流的競爭，主要是通過還原性三羧酸循環(huán)途徑進(jìn)行，到后期在磷酸烯醇式丙酮酸脫羧酶作用下形成草酰乙酸后，促進(jìn)了三羧酸循環(huán)的進(jìn)行，使得丁二酸在三羧酸循環(huán)途徑中較多地轉(zhuǎn)化從而降低了丁二酸的產(chǎn)量。因此，在發(fā)酵過程中，控制發(fā)酵時間是至關(guān)重要的。此外，對于細(xì)胞代謝的丙酮酸節(jié)點(diǎn)，細(xì)胞外的含量遠(yuǎn)高于細(xì)胞內(nèi)，但總體上來看，都呈現(xiàn)上升的趨勢，推測在發(fā)酵早期(6～12 h)，氧化性三羧酸循環(huán)已經(jīng)開始競爭丁二酸合成支路的代謝流分布，在發(fā)酵的中后期(24～36 h)，由于較多的代謝流分布于氧化性三羧酸循環(huán)，并且有少量的乳酸副產(chǎn)物的產(chǎn)生，使得后期丁二酸的濃度有降低的趨勢。