四川傳統(tǒng)泡菜中乳酸菌分離與鑒定

李玉德，黃慶才

(米易華森糖業(yè)有限責任公司，四川攀枝花 617200)

0 引言

四川泡菜是優(yōu)質中國泡菜的代表[1]，具有鮮、香、嫩、脆和甜的特點。是四川人民餐桌上的一道重要的小菜.傳統(tǒng)的泡菜制作工藝是以新鮮蔬菜為原料，經過擇菜、洗菜、切分與晾干，加食鹽水和老泡菜水，腌漬發(fā)酵制作而成，腌漬過程中通過加入食鹽形成高滲環(huán)境抑制有害微生物生長，蔬菜表面和老泡菜水中以乳酸菌為主的有益菌在發(fā)酵過程逐漸形成優(yōu)勢[2]，促進泡菜風味的形成.傳統(tǒng)工藝完全依賴經驗，品質不穩(wěn)定，質量難以保證，且常出現亞硝酸鹽超標、腐敗菌和病源菌引起的食品安全問題.一直以來，泡菜中的亞硝酸鹽問題是消費者密切關注的的食品安全問題[3].亞硝酸鹽能夠使血紅蛋白氧化生成高鐵血紅蛋白，導致低氧血癥，在體內可轉化生成致癌物亞硝胺，導致胃癌、甲狀腺癌等疾病[4-5].傳統(tǒng)泡菜工業(yè)生產與家庭制作均存在著發(fā)酵周期長、亞硝酸鹽含量不可控等問題.在泡菜發(fā)酵前期，細菌的硝酸鹽還原酶將硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽，導致亞硝峰出現.在發(fā)酵后期，隨著酸度的升高，乳酸菌中的亞硝酸鹽還原酶和產酸協(xié)同可迅速降解亞硝酸鹽，有機酸降解是亞硝酸鹽降解的主要方式[6].在泡菜腌漬過程中進行強化優(yōu)質乳酸菌，既可以抑制有害菌生長，又可以快速產酸、降解亞硝酸鹽，是提升泡菜品質的重要途徑[7-9].本研究從傳統(tǒng)四川泡菜中分離乳酸菌，對其降亞硝酸鹽、產酸性能進行檢測，篩選產酸能力與降亞硝酸鹽能力強的乳酸菌，從而為工業(yè)化生產提供優(yōu)質乳酸菌.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采用無菌方法，在采用傳統(tǒng)方法制作的優(yōu)質泡菜中取得泡菜水，密封保存于4℃冰箱，24 h內開展后續(xù)實驗.

1.2 實驗藥品

葡萄糖、三水合乙酸鈉、檸檬酸氫二胺、四水磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、溴甲酚綠、氯化鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉，均為分析純；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、瓊脂均為生物試劑.

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 MRS液體培養(yǎng)基 葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，三水合乙酸鈉5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，四水磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸鎂2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫801.0 mL，調節(jié)pH至6.2～6.6，定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min.

1.3.2 MRS固體培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基的基礎上，以1 000 mL添加20 g瓊脂，調節(jié)pH至6.2～6.6，121 ℃滅菌20 min.

1.3.3 乳酸菌鑒別培養(yǎng)基 在MRS固體培養(yǎng)基的基礎上，另加0.01%溴甲酚綠作指示劑.

1.4 儀器和設備

超凈工作臺(江蘇蘇凈)、高壓滅菌鍋(上海申安)、恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒)、紫外可見分光光度計(北京普析)、酸度計(上海雷磁)、電子天平(上海舜宇).

1.5 乳酸菌的分離與純化

將泡菜水解凍后在無菌條件下取1mL于無菌試管中，再用無菌生理鹽水做稀釋梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7.用移液槍分別取10-5、10-6、10-7各0.2 mL涂布到乳酸菌鑒別培養(yǎng)基上，再將培養(yǎng)基放置在干燥器中，蓋上蓋子，通過點蠟燭燃燒消耗氧氣，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng).培養(yǎng)72 h后，取出培養(yǎng)基，挑出讓培養(yǎng)基變色的菌種，用劃線接種法接種到新的乳酸菌鑒別培養(yǎng)基上，如此反復，直到分離純化出純菌落，此時的菌種初步鑒定為乳酸菌，并對菌株進行編號.將篩選出的乳酸菌用劃線法接種到乳酸菌鑒別培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h后觀察其菌落在固體培養(yǎng)基中生長情況及形態(tài)、大小.

1.6 產酸能力測定

將經過分離、純化的菌種接種到20 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫滅氧培養(yǎng)18 h，再以1%的接種量接種到150 mL的液體MRS培養(yǎng)基中，每隔12 h用pH計測pH值.

1.7 降亞硝酸鹽能力檢測

1.7.1 亞硝酸鹽標準曲線 根據參考文獻[10]中的分光光度法，繪制標準曲線如圖1所示，亞硝酸鈉濃度(μg/mL)與吸光度之間的線性方程為y=0.013 8x+0.011 2(R2=0.999 6)，呈良好的線性關系.

圖1 亞硝酸鹽標準曲線Fig.1 standard Curve of Nitrite

1.7.2 乳酸菌的亞硝酸鹽降解率測定 從MRS固體培養(yǎng)基上挑取單菌落接種到20 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫條件下培養(yǎng)18 h(菌種處于對數生長期)，將活化后的菌懸液以1%的接種量接種到100 mL含有20 mgNaNO2(質量濃度為200 μg/mL)的滅菌的MSR液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h，依據參考文獻5中的分光光度法測定發(fā)酵液中的亞硝酸鹽含量(X)，計算亞硝酸鹽降解率.

1.8 分子生物學鑒定

將分離獲得的乳酸菌接種到液體MRS培養(yǎng)基中活化16 h，吸取1.5 mL菌液于1.5 mL離心管中，采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，冷凍保存，參照文獻[2]擴增細菌16S rDNA，將擴增樣品送上海生工測序.登錄Eztaxon網站(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)將測序結果通過序列比對鑒定.

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離及形態(tài)觀察

根據實驗方法1.5分離泡菜水中的乳酸菌，共獲得10株變色明顯的乳酸菌.在乳酸菌分離培養(yǎng)過程中，采用的是乳酸菌鑒別培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是在MRS固體培養(yǎng)基的基礎上添加0.01%的溴甲酚綠，溴甲酚綠為酸堿指標劑，pH=5.4時呈藍綠色，在pH=3.8時呈黃色，pH為4.5時開始有顏色變化.此次分離得到的10株乳酸菌在鑒別培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，菌落周圍的藍綠色基本褪去，呈黃色，表明菌落周圍的pH=3.8左右，呈較強的酸性.將分離獲得的菌在37℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h后，菌落在固體培養(yǎng)基中生長情況及形態(tài)、大小如表1所示.

由表1可知，LAB-1-1、LAB-1-2、LAB-1-5的生長速度最快，LAB-1-3、LAB-1-4、LAB-2-2的生長速度較好，LAB-2-3、LAB-2-5的生長速度最慢，所分離獲得的10株乳酸菌均呈白色、小點狀、光滑及濕潤的菌落形態(tài).

2.2 產酸特性測定

根據實驗方法1.6將分離獲得的10株乳酸菌接種到20 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)18 h,再接種到盛有150 mL液體MRS培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，每隔12 h測定其pH值，結果如表2所示.

由表2可知，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，10株乳酸菌的發(fā)酵液的pH值均降至4.5以下，24 h時，除LAB-1-1、LAB-1-5、LAB-2-1的pH大于4以外，其它乳酸菌均低于4，當發(fā)酵培養(yǎng)60 h時所有菌株的pH均達到3.8以下，表明分離獲得的10株菌都具有良好的產酸特性，彼此之間的產酸能力差異較小.

2.3 降亞硝酸鹽性能評價

根據實驗方法1.7對10株菌的降亞硝酸鹽能力進行檢測，結果如表3所示.

從表3可知，10株乳酸菌均對亞硝酸鈉具有降解能力，以LAB-1-5的降解能力最強，達到97.8%.蔬菜中含較高濃度的硝酸鹽，尤其是一些根菜類、葉菜類蔬菜的硝酸鹽含量高達1 500 mg/kg左右[11].硝酸鹽在泡菜腌漬發(fā)酵過程中可以在一些微生物的作用下還原生成亞硝酸鹽，后者可進一步可轉化生成具有較強的致癌性的亞硝胺，對消費者的身體健康形成潛在的危害.在蔬菜腌漬過程中添加乳酸菌可以促進亞硝酸降解，降低產品中的亞硝酸鹽含量.王英等[12]將具有優(yōu)良降解亞硝酸鹽性能的植物乳桿菌應用西蘭花莖泡菜制作，發(fā)酵9 d時亞硝酸鹽降至0.3 mg/kg以下.于沛等[13]從自然發(fā)酵泡菜中篩選得到高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌，在發(fā)酵蘿卜生產中應用，產品的亞硝酸鹽含量降至0.5 mg/kg以下.尹禮國等[14]從宜賓芽菜中篩選得到5株產酸能力強的乳酸菌、降亞硝酸鹽能力均在90%以上，應用于低鹽宜賓芽菜制作，可將產品的亞硝酸鹽降至1.5 mg/kg左右.本研究獲得的10株乳酸菌可進一步應用于泡菜生產，檢測其在生產實踐過程中降解泡菜中亞硝酸鹽能力.

2.4 乳酸菌分子生物學鑒定

根據實驗方法1.8對10株乳酸菌進行鑒定，結果如表4所示.

表4 乳酸菌分子鑒定Tab.4 Molecular Identification of Lactic Acid Bacteria

由表3可以得知，10株乳酸菌中9株菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)，1株為片球菌屬(Pediococcus).根據Bosshard等[15]提出的16S rDNA序列相似率>99%定義為種，95%～99%可定義為屬的標準，所有10株菌尚不能定義至種，需要進一步開展生理生化代謝特性研究.劉玉凌等[16]從重慶農戶自制老鹽水中分離到一株乳酸菌，經分子生物學鑒定為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，結合腸膜明串珠菌制備復合發(fā)酵劑應用于泡菜制作，可以提高產酸速度，明顯降低亞硝酸鹽峰值，提高食用安全性，感官品質也優(yōu)于自然發(fā)酵的泡菜.為了進一步對分離得到的乳酸菌進行開發(fā)應用，需要對它們的生長特性與發(fā)酵特性開展研究.

乳酸菌是一類能將糖類化合物轉化生成大量乳酸的細菌的總稱，是一種習慣提法，具有物種多樣性，廣泛應用于食品工業(yè)、醫(yī)藥產業(yè)和農業(yè)生產.四川泡菜中的乳酸菌資源豐富，Nguyen等[17]從一種越南發(fā)酵蔬菜中分離到881株乳酸菌，其中56.6%為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，Xiong等[18]從泡菜水中分離到耐膽鹽、膽酸的植物乳桿菌植物亞種(Lactobacillusplantarumsubsp.Plantarum)，烏日娜等(2014年)[19]從東北酸菜中分離到24株乳酸菌，分別為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、Lactobacilluscurvatus、Lactobacillusparacasei、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides).本研究根據企業(yè)生產實踐需求，從四川泡菜中分離獲得的10株乳酸菌分別為乳桿菌屬和片球菌屬，具有較好的產酸、降亞硝酸鹽能力，可進一步開發(fā)為具有自主知識產權的生產用菌.在后期研究中，可采集更多的優(yōu)質樣品分離獲得更多的菌種資源，保障泡菜產品品質與食品安全.

研究發(fā)酵食品中的微生物多樣性除了經典的微生物培養(yǎng)方法外，現代分子生物學技術也是重要的手段.微生物培養(yǎng)技術只能獲得環(huán)境中的部分微生物信息，為了全面了解四川泡菜的微生態(tài)信息，需要采用基于分子生物學技術的免培養(yǎng)技術開展研究.裴樂樂等[20]通過構建16S rRNA基因文庫對4種鹽漬菜細菌群落進行了分析，乳桿菌屬與鹽單孢菌屬(Halomonas)是鹽漬榨菜的優(yōu)勢屬，乳桿菌屬、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)和鹽單孢菌屬是鹽漬蘿卜的優(yōu)勢屬，紅桿菌科未分類細菌屬(UnclassifiedRhodobacteraceae)、乳桿菌屬等細菌屬是鹽漬豇豆的優(yōu)勢細菌屬，紅桿菌科未培養(yǎng)細菌屬(UnclassifiedRhodobacteraceae)、鹽單胞菌屬、海洋桿菌屬(Marinobacter)、需鹽桿菌屬(Salegentibacter)是鹽漬青菜的優(yōu)勢細菌屬.陳希等[21]采用建立16S rDNA克隆文庫的方法對不同腌漬階段的雪菜的細菌多樣性進行了研究，結果表明，整個腌漬過程中微生物種類豐富，不同時期存在較大差異，腌制初期的優(yōu)勢菌群為腸桿菌屬(Enterobacter)和歐文菌屬(Erwinia)，發(fā)酵中后期以乳桿菌屬的植物乳桿菌為主導.尹禮國等[2]采用PCR-DGGE對不同鹽漬青菜樣品的細菌群落結構進行了分析，乳桿菌屬、魏斯氏菌屬等細菌是主要細菌屬.高通量測序技術是近年來開發(fā)的一種高效分子測序技術，在發(fā)酵食品微生態(tài)研究中得到了廣泛應用.佟婷婷等[23]采用高通量測序技術對泡菜細菌群落結構研究表明乳桿菌屬、魏斯氏菌屬(Weissella)等細菌是主要細菌屬.

3 結論

本研究從四川傳統(tǒng)泡菜中分離得到10株菌，均具有良好的產酸與降亞硝酸鹽性能，其中菌株LAB-1-5的降亞硝酸鹽性能最高(97.8%).經過分子生物學鑒定，9株菌為乳桿菌屬，1株菌為片球菌屬.本研究以企業(yè)生產需求為導向，建立了優(yōu)質乳酸菌分離篩選的方法，對促進企業(yè)科技轉型具有重要意義.后期研究中，進一步加強優(yōu)質樣品采集，以分離獲得更多的菌種資源，保障泡菜產品品質與食品安全.