蛋白激酶R樣內質網(wǎng)激酶通路與糖尿病腎病

龐欣欣 彭紫凝 邢玉鳳 張雅歌 石秀杰 韓佳瑞

450002 鄭州，河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院)腎病科(龐欣欣，韓佳瑞)；450046 鄭州，河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院(彭紫凝，邢玉鳳，張雅歌，石秀杰，韓佳瑞)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一，是導致ESRD的重要原因，大約35%～40%的1型或2型糖尿病患者會發(fā)展為DKD[1]。DKD發(fā)病機制復雜，目前尚不完全清楚，仍需進一步深入研究其發(fā)病機制[2]。

內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在DKD發(fā)病及進展中被證實占有重要地位[3]。ERS指因某些病理因素導致內質網(wǎng)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打亂的細胞內環(huán)境狀態(tài)，其中未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)是目前研究最為廣泛的一種ERS[4]。在UPR中，有3種反應感受蛋白起主導作用，其中就包括蛋白激酶R樣內質網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)。

PERK是URP發(fā)生時最先被活化的跨膜蛋白[5]。PERK可以通過磷酸化真核細胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)，并通過活化轉錄活化因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，直接或間接促進下游促生存蛋白和促死亡蛋白的表達。PERK信號通路參與細胞內多種生命活動過程，在DKD發(fā)病以及進展中可能發(fā)揮重要作用[6]。本文對PERK通路在DKD發(fā)病機制中的研究進展進行綜述。

一、PERK通路的生物學特征及功能

PERK是位于內質網(wǎng)的一種ERS跨膜感受蛋白，具有絲氨酸蛋白激酶的活性。在ERS未發(fā)生時，PERK作為與葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)結合的非活性單體存在，固定在內質網(wǎng)膜上，具有較為穩(wěn)定的結構[7]。ERS發(fā)生時，內質網(wǎng)腔內大量的UPR與GRP78蛋白結合，使PERK和GRP78蛋白的結合率降低，激活PERK通路。PERK與GRP78蛋白解離后，PERK發(fā)生二聚化，并自磷酸化，激活激酶域[8]，活化的PERK可以磷酸化eIF2α，抑制蛋白質合成，繼而可以恢復內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)或促進細胞凋亡，激活轉錄因子ATF4，在細胞內多種生命活動過程中起著關鍵作用。

一方面，在輕度激活的PERK通路中，ATF4上調誘導磷酸化eIF2α的下游靶點-生長停滯與DNA損害可誘導基因34(growth arrest and DNA damage inducible protein 34，GADD34)磷酸酶的活性，GADD34表達可以通過去磷酸化eIF2α負反饋調節(jié)PERK通路，提高蛋白質折疊能力，促進PERK與GRP78蛋白結合，減輕ERS。與此同時，ATF4可以進一步激活自噬、抗氧化反應、氨基酸的合成和轉運，促進細胞生存[9]。另一方面，當PERK通路被持續(xù)激活時，ATF4水平持續(xù)上調，不僅激活GADD34，還能促進C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)基因的表達，其表達活化了細胞凋亡途徑[10]。在此過程中，ATF4-CHOP異二聚體啟動修復mRNA翻譯，導致蛋白質合成增加，促進氧化應激和細胞凋亡[9]。

PERK通路參與機體對應激因素的反應過程，可通過PERK通路不同部位的特異性調節(jié)，干預細胞存活或死亡。例如，PERK直接抑制劑GSK 2656157可以抑制PERK蛋白的表達，調節(jié)PERK通路參與的各種應激反應[11]。ERS抑制劑4PBA可以干預細胞eIF2α磷酸化，下調CHOP蛋白表達，參與整體調控PERK通路[12]。綜合應激反應抑制劑ISRIB，可以通過抑制雌激素受體，來抑制ATF4的表達，調節(jié)PERK通路，阻斷UPR激活[13]。Guanabenz和Sephin1可以選擇性地抑制體內蛋白磷酸酶1的亞基，作用于GADD34使eIF2α持久磷酸化，參與PERK通路的調節(jié)[14]。選擇性CHOP激動劑Sulfonamidebenzamides可以上調轉錄因子CHOP的mRNA表達，參與調控PERK通路等[15]，以上都可能通過精細調節(jié)PERK通路來干預細胞的存活或死亡。

二、PERK通路與DKD發(fā)病機制

在DKD中，多種因素如糖脂代謝紊亂、炎癥、晚期糖基化終產物(advanced glycation end-products，AGEs)、血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)等均可以導致ERS的發(fā)生，誘導UPR反應，進而激活PERK通路[16]。適度的PERK通路激活能夠通過促進ATF4形成，激活GADD34，緩解PERK自磷酸化，參與機體穩(wěn)態(tài)的調節(jié)。但過度激活可破壞PERK通路平衡，增加 ATF4產生，上調CHOP蛋白表達，促進炎癥因子、活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)形成，進而誘導足細胞損傷或凋亡，促進膠原沉積等，加重DKD。同時PERK通路的過度激活，還可通過ATF4抑制細胞自噬功能，加重DKD進展[9]。(圖1)

注：AGEs：晚期糖基化終產物；Ang Ⅱ：血管緊張素Ⅱ；GRP78：葡萄糖調節(jié)蛋白78；ERS：內質網(wǎng)應激；eIF2α：真核細胞起始因子2α；ATF4：轉錄活化因子4；ROS：活性氧自由基；GADD34：生長停滯與DNA損害可誘導基因34；Bax：Bcl-2相關X蛋白；CHOP：C/EBP同源蛋白；DKD：糖尿病腎??；GSK 2656157為PERK抑制劑；ISRIB為ATF4抑制劑；Sulfonamidebenzamides為CHOP激動劑；Guanabenz、Sephin1為GADD34抑制劑。圖1 PERK通路與DKD發(fā)病機制

1.PERK通路與細胞凋亡 細胞凋亡是一種可由多種途徑誘發(fā)的細胞程序性死亡，與DKD腎臟損害密切相關。不少研究證實了PERK通路參與調控DKD細胞凋亡的發(fā)生[17]，抑制PERK通路可以保護細胞，阻止細胞凋亡。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)PERK通路的激活參與DKD足細胞凋亡的過程，黃芪甲苷Ⅳ可以通過下調PERK-ATF4-CHOP通路來阻止ERS誘導的足細胞凋亡。Huang等[19]研究證實抑制PERK通路可以阻止腎小管上皮細胞凋亡，在DKD小鼠中，羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白1過表達可以降低磷酸化eIF2α的表達，抑制PERK通路，阻止了腎小管上皮細胞凋亡。

但是，也有研究發(fā)現(xiàn)阻斷PERK通路可能會促進細胞凋亡。Ji等[20]研究表明，在ERS發(fā)生時，PERK在人骨肉瘤細胞中高表達，敲除PERK導致細胞中GRP78蛋白增加，磷酸化eIF2α水平上升，促進CHOP蛋白的表達和上調caspase-3蛋白水平，導致人骨肉瘤細胞凋亡，表明阻斷PERK通路可以促進人骨肉瘤細胞凋亡。但在DKD中，目前普遍認為PERK通路發(fā)揮促凋亡作用，尚未有文獻在DKD中報道PERK通路能抑制細胞凋亡，阻斷PERK通路導致的細胞凋亡可能是DKD的治療靶點。

2.PERK通路與炎癥 炎癥在DKD的發(fā)病機制中起著至關重要的作用[21]。不少研究證實下調PERK通路可以抑制炎癥。Hu等[22]認為，DKD中有大量炎癥因子或促炎因子，刺激ERS發(fā)生，PERK通路在內質網(wǎng)腔被激活，PERK蛋白表達上調，磷酸化eIF2α水平上升，連接蛋白43表達下調，繼而腎功能下降，一種大黃酸和L-精氨酸合成的新化合物可以通過抑制PERK蛋白表達，下調PERK-eIF2α通路，減弱內質網(wǎng)應激，上調連接蛋白43表達，繼而減少DKD中的促炎因子，減緩DKD發(fā)病進展。Chen等[23]認為，PERK通路參與了DKD的炎癥進程，在DKD中，AGEs進一步促進GRP78蛋白表達上調，PERK磷酸化，炎癥因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)等因子增加，牡丹皮萜苷類成分可以下調GRP78蛋白和磷酸化PERK表達，抑制PERK通路，減少IL-6等相關炎癥因子，減弱DKD中ERS相關炎癥。

然而，阻斷PERK通路也可能加重DKD的炎癥反應。Guthrie等[24]研究發(fā)現(xiàn)，PERK通路在炎癥中具有雙重調節(jié)作用，一方面PERK抑制劑作用于星形膠質細胞，證實PERK抑制劑可以下調PERK通路中ATF4和CHOP的表達，導致ERS 誘導的炎癥因子IL-6、趨化因子2(chemokine 2，CCL2)和 CCL20減少，另一方面，完全敲除PERK后阻斷了依賴性UPR反應，減少ERS誘導的IL-6表達，但是沒有減少ATF4和CHOP蛋白的表達，反而加重了炎癥反應，為研究阻斷PERK通路可促進DKD炎癥反應提供理論依據(jù)。但目前來看，PERK通路抑制炎癥的研究較少，而PERK通路激活促進DKD的炎癥機制已被較多研究證實。我們推測，在DKD中，各種因素導致的持續(xù)ERS使得PEKR通路的激活可能是DKD作為免疫炎癥性疾病的重要病因。

3.PERK通路與氧化應激 ROS是需氧細胞在代謝過程中產生的一系列活性氧集簇，ROS廣泛存在于DKD患者中，ROS產生同時抗氧化物質減少，造成腎組織的氧化應激狀態(tài)[25]，在DKD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。大量研究證實，抑制PERK通路可以減弱氧化應激。Cao等[26]研究表明，在DKD中，ERS發(fā)生促進ROS產生，內質網(wǎng)應激抑制劑熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)抑制腎小球和腎小管中GRP78蛋白的表達，并進一步下調磷酸化PERK和CHOP蛋白的表達，因此UDCA可以抑制PERK通路并減少高糖誘導下足細胞產生的ROS，減弱ERS誘發(fā)的氧化應激，延緩DKD進展。林浩飛等[27]認為，PERK通路影響細胞氧化應激，十溴聯(lián)苯醚誘導的小鼠海馬神經(jīng)元細胞中，GRP78蛋白和PERK表達上調，CHOP蛋白和Bcl-2升高，PERK通路激活，氧化指標超氧化物歧化酶顯著降低，一氧化氮和丙二醛升高，表明氧化應激水平上調，證實PERK通路參與細胞中氧化應激，抑制PERK通路可以減緩細胞內氧化應激。Verfaillie等[28]研究證實，在ROS介導的ERS過程中，PERK通路通過維持促凋亡CHOP蛋白的水平和促進內質網(wǎng)和線粒體之間ROS信號的傳播而促進細胞死亡，因此在PERK減少的細胞中CHOP蛋白表達降低，細胞凋亡減弱，同時氧化應激介導的線粒體損傷減弱，這表明抑制PERK通路能夠減緩細胞內氧化應激，進而阻止細胞損傷。也有研究發(fā)現(xiàn)，低劑量ERS誘導劑TM可以激活適度的ERS發(fā)生，激活PERK通路來減輕糖尿病心臟缺血/再灌注損傷[29]。說明PERK通路在DKD氧化應激損傷的雙面性。大多數(shù)研究表明，在DKD中PERK通路可以促進ROS產生，抑制PERK通路可以減弱氧化應激，緩解DKD。

4.PERK通路與自噬 自噬是發(fā)生在細胞內的一種適應性改變的分解代謝過程[30]。在DKD發(fā)病過程中，自噬與多種細胞損傷有關[31]。目前多數(shù)研究表明，抑制PERK通路可以促進細胞自噬。Fang等[32]研究表明，PERK通路的激活參與調節(jié)DKD中的自噬，而內質網(wǎng)抑制劑可以通過下調PERK通路，減緩eIF2α磷酸化，下調促凋亡的CHOP基因的表達，增加自噬相關蛋白表達以恢復DKD中受損的自噬功能。Chiang等[12]研究證實，AGEs能夠誘導DKD系膜細胞ERS發(fā)生，進一步激活eIF2α的磷酸化，上調GRP78、ATF4和CHOP蛋白表達，而內質網(wǎng)應激阻斷劑4-苯基丁酸通過下調PERK-ATF4-CHOP通路來激活自噬，進而阻止了細胞凋亡，因此，抑制PERK通路可以刺激自噬保護細胞，緩解DKD進展。

阻斷PERK通路也有可能抑制細胞自噬。Wang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，PERK通路可以調控自噬激活，如腎臟近曲小管細胞在鉛誘導下發(fā)生ERS，促使PERK磷酸化繼而激發(fā)eIF2α-ATF4 -CHOP通路，激活PERK通路，顯著抑制細胞中自噬通量，促進鉛誘導的細胞凋亡，從而產生腎毒性，而敲除PERK阻斷PERK通路后，自噬標記蛋白水平和自噬小體積累明顯降低，因此阻斷PERK通路會損傷細胞自噬進而導致腎毒性。鐘申熹等[34]研究認為，以PERK通路抑制劑預處理人骨肉瘤細胞后行光動力療法處理，PERK通路受到阻滯，下游信號分子ATF4表達降低，同時自噬相關蛋白表達降低，自噬活性受到抑制。這些研究為阻斷PERK通路導致自噬抑制進而加重DKD進展提供了理論依據(jù)。就目前研究，PERK通路激活抑制DKD的自噬已被證實。我們推測，在DKD中，持續(xù)ERS發(fā)生而激活PEKR通路可能導致DKD自噬功能被抑制或喪失，進而促進疾病發(fā)生。阻斷PERK通路能否抑制自噬進而加重DKD仍缺乏文獻報道，尚有待進一步研究。

5.PERK通路與血管緊張素Ⅱ AngⅡ在DKD發(fā)展中起到中心作用[35-36]。適度下調PERK通路減少AngⅡ的產生，減緩DKD進展，呂振嶸等[37]研究表明，AngⅡ可以誘導心肌細胞的PERK、eIF2α和CHOP蛋白表達升高，細胞中ERS激活PERK-eIF2α通路進一步參與AngⅡ誘導心肌細胞的肥大過程，并且促進CHOP介導的細胞凋亡途徑，因此PERK通路參與AngⅡ誘導的細胞損害。Liu等[38]研究表明，血管緊張素I型受體阻滯劑可抑制AngⅡ介導的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)合成，特異性VEGF受體抑制劑SU5416可以下調磷酸化VEGF受體和磷酸化PERK的表達，可以通過下調PERK通路，抑制VEGF來影響AngⅡ，保護足細胞，治療DKD。Ha等[39]研究證實，AngⅡ可以通過增加磷酸化PERK和ATF4蛋白，激活PERK通路，誘導內質網(wǎng)上PERK-eIF2α-ATF4通路上調，導致足細胞損傷。所以在DKD中，PERK通路不僅可以調節(jié)AngⅡ的生成，而且參與AngⅡ的致病機制。以上研究表明，可以通過下調PERK通路來抑制ERS，減少AngⅡ的產生，緩解DKD。

6.PERK通路與其他 PERK通路可能通過影響多種因素，參與DKD的發(fā)病以及進展。Park等[40]研究證實，在DKD中，PRMT1表達誘導促進PERK通路上調，激活磷酸化eIF2α，促使CHOP蛋白表達，所以下調PERK通路可以抑制PRMT1的表達，阻止在DKD中ERS誘導的系膜細胞凋亡，緩解DKD。Pei等[41]研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食能通過PERK通路加重小鼠胰島素抵抗。Bao等[42]研究發(fā)現(xiàn)PERK通路參與了高糖誘導的腎小管上皮細胞上皮間充質轉分化過程。

從ERS的功能角度來看，適度的激活PERK通路可以發(fā)揮保護作用，而過強或者長時間的激活可能加重損傷。但是，由于PERK通路的機制和功能復雜性，研究結果尚不完全一致。一些研究在其他疾病模型中證實了PERK通路的保護作用，但在DKD中，多數(shù)研究認為PERK通路的激活可以通過誘導凋亡、促進炎癥、抑制自噬、促進氧化應激損傷等機制發(fā)揮致病作用，阻斷PERK通路引起的各種損傷機制已被證明是不少新型DKD治療藥物的潛在機制。

三、結語

綜上所述，已有大量研究表明，PERK通路可以調控細胞凋亡、炎癥、氧化應激、自噬、AngⅡ等，在DKD的發(fā)病和進展中發(fā)揮重要作用[36，43]。未來研究可以通過(1)直接促使藥物作用于腎臟細胞中PERK通路，使PERK通路下調保護細胞，延緩DKD發(fā)病；(2)反向利用藥物，尋找合適的藥物阻斷對腎臟有損害的細胞中PERK通路，以此來減少對腎臟有損害的細胞，達到治療DKD的目的；(3)可以通過藥物特異性作用于PERK通路的上游或下游分子，如PERK通路的抑制劑ISRIB等等，抑制ATF4調控PERK通路在DKD中的作用，進而阻止DKD進程。簡而言之，對PERK通路的精細調控，可以有效防治DKD。我們可以更進一步的挖掘PERK通路在DKD中的作用，為DKD的防治提供更有效的治療靶點。