支氣管鏡導(dǎo)引下圈套器電灼損傷在犬氣管狹窄模型中的應(yīng)用

趙 純，向述天，蘇 偉，曾俊仁，徐 松，趙娟娟，毛崇文，代洪妍

氣管支氣管狹窄包括腫瘤所致惡性狹窄，氣管內(nèi)插管、氣管切開術(shù)及氣管支氣管良性疾病等所致良性狹窄［1］。 隨著氣管插管技術(shù)普遍應(yīng)用，1%～4%患者拔管后出現(xiàn)不同程度氣管狹窄［2］。 目前良性氣管狹窄處理技術(shù)仍不盡如人意，手術(shù)切除存在顯著并發(fā)癥，金屬支架植入后再狹窄發(fā)生率較高。 為探尋預(yù)防和治療氣管狹窄方法，建立操作可靠、簡(jiǎn)單且重復(fù)性良好的氣管狹窄模型顯得尤為重要。 本研究旨在探討纖維支氣管鏡導(dǎo)引下圈套器電灼損傷在犬氣管狹窄模型構(gòu)建中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備器材

選擇健康成年比格犬10 只（昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），年齡（1.0±0.2）歲，體重 9～12 kg，雌雄不限。 手術(shù)前行CT 檢查，排除先天性氣管畸形。主要設(shè)備器材：MBC-5 型便攜式纖維支氣管鏡（上海澳華光電內(nèi)窺鏡公司）、Aquilion ONE 型640 層動(dòng)態(tài)容積CT 機(jī)（日本Toshiba 公司）、一次性息肉切除器（常州市久虹醫(yī)療器械公司）

1.2 氣管狹窄模型構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)犬術(shù)前常規(guī)禁食、禁水6 h。 實(shí)驗(yàn)犬在3%戊巴比妥鈉（25 mg/kg）靜脈內(nèi)麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，固定頭后仰；拉伸犬舌頭，將開口器置于口腔一側(cè)；大腿外側(cè)備皮。 術(shù)中遇犬恢復(fù)反射時(shí)，按3 mg/kg 靜脈內(nèi)追加戊巴比妥鈉。 電圈套器通過纖維支氣管鏡導(dǎo)引進(jìn)入氣管后，打開二分之一圈套環(huán)并置于鞘管外，準(zhǔn)確定位距離聲門8 cm 中段氣管軟骨上；圈套器通過絕緣手柄與高頻電刀相連，電極片緊貼已備皮區(qū)域大腿皮膚，高頻電刀參數(shù)設(shè)置為35 W、1 MHz，在氣管C 形軟骨環(huán)上定位8 個(gè)燒灼點(diǎn)（均勻分布），分別燒灼3 次，每次持續(xù)6 s。注意操作時(shí)盡量環(huán)狀損傷氣管軟骨部，灼燒深度約至氣管軟骨層，避免直接燒灼氣管膜部，以防止發(fā)生氣管食管瘺。 術(shù)后保存支氣管鏡圖像，CT 檢查觀察有無縱隔氣胸等并發(fā)癥，保溫下犬麻醉復(fù)蘇。

1.3 術(shù)后觀察

①一般清況：術(shù)后觀察并記錄實(shí)驗(yàn)犬氣管損傷后存活與否，有無急性呼吸窘迫、咳嗽，進(jìn)水后有無嗆咳等，記錄出現(xiàn)氣促、肋間隙凹陷時(shí)間。 ②支氣管鏡檢查：術(shù)后每周1 次，觀察氣管內(nèi)膜損傷修復(fù)及氣管狹窄清況，評(píng)價(jià)損傷表面炎癥、肉芽增生程度。為保證圖像同質(zhì)性，采集圖像時(shí)將鏡頭置于距損傷部位上約 1 cm 處。 ③CT 檢查：術(shù)后每周 1 次，觀察氣管內(nèi)壁厚度、氣管狹窄程度、軟骨環(huán)清況及肺部感染等并發(fā)癥。 ④組織病理學(xué)分析：觀察氣管結(jié)構(gòu)是否完整、肉芽組織增生清況。 狹窄最明顯段切片行蘇木精-伊紅（HE）和Masson 染色，采用校準(zhǔn)顯微鏡、 數(shù)字視頻成像系統(tǒng)檢測(cè)氣管狹窄段黏膜層、黏膜下層厚度，黏膜下炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化程度，Olympus 攝像系統(tǒng)攝影。

1.4 狹窄程度計(jì)算

術(shù)后實(shí)驗(yàn)犬氣管狹窄程度計(jì)算公式為：（S-s）/S×100%，其中 S 指插管前氣管管腔面積，s 指檢查時(shí)氣管管腔面積，均在CT 檢查圖像上測(cè)取。 每次圖像采集后均計(jì)算狹窄率。 狹窄程度用中位數(shù)（M）及4 分位數(shù)間距（QR）表示。 根據(jù) Carolina 分級(jí)［3］對(duì)氣管狹窄程度進(jìn)行分級(jí)：0 級(jí)，無狹窄；1 級(jí)，1%～20%狹窄；2 級(jí)，21%～40%狹窄；3 級(jí)，41%～60%狹窄；4級(jí)，61%～80%狹窄；5 級(jí)，＞80%狹窄。 犬氣管狹窄程度＞80%，即視為造模成功。

2 結(jié)果

10 只實(shí)驗(yàn)犬順利完成氣管電灼傷術(shù)，造模成功。 術(shù)后均出現(xiàn)輕微咳嗽癥狀，觀察期內(nèi)無加重，無進(jìn)水后嗆咳。 1 只犬于術(shù)后14 d 處死，另1 只嚴(yán)重氣管狹窄，呼吸困難，于術(shù)后25 d 處死（稍短于設(shè)計(jì)的28 d），8 只犬存活至1 個(gè)月觀察終點(diǎn)。 所有犬最遲至術(shù)后14 d、19 d 分別出現(xiàn)喘息、肋間隙凹陷，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)犬氣管狹窄程度與呼吸時(shí)出現(xiàn)喘息、肋間隙凹陷時(shí)間

支氣管鏡檢查顯示，術(shù)前犬氣管黏膜光滑、完整，術(shù)后形態(tài)正常無塌陷；術(shù)后14 d 氣管損傷處黏膜充血、水腫緩解，部分區(qū)域出血、潰瘍，可見中度肉芽組織增生，管腔內(nèi)少許分泌物，氣管狹窄明顯；術(shù)后21 d 可見大量肉芽組織形成，潰瘍減輕、無出血，表面分泌物附著；術(shù)后28 d 肉芽增生嚴(yán)重，管腔嚴(yán)重狹窄，表面黏膜生長(zhǎng)恢復(fù)，狹窄后方大量分泌物堵塞，見圖 1。

圖1 氣管狹窄支氣管鏡檢查結(jié)果

CT 檢查顯示，術(shù)前犬氣管軟骨完整、內(nèi)壁厚度均勻一致；術(shù)后7 d CT 骨窗見部分氣管內(nèi)壁缺損和軟骨缺損、斷裂；術(shù)后14 d 氣管腔稍狹窄；術(shù)后21 d可見大量肉芽組織伴氣管軟骨環(huán)塌陷，重度氣管狹窄形成，狹窄長(zhǎng)度1 cm；術(shù)后28 d 狹窄程度進(jìn)一步加重，見圖2。 氣管狹窄程度中位數(shù)在術(shù)后7 d、14 d分別為26%、72%，術(shù)后21 d、28 d 分別可達(dá)86%、90%（表 1），隨后狹窄進(jìn)展逐漸減緩。 術(shù)后 14 d 所有犬氣管狹窄程度均已達(dá)5 級(jí)狹窄（表1）。 不同時(shí)間點(diǎn)狹窄程度變化見圖3。

圖2 氣管狹窄CT 檢查結(jié)果

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)狹窄程度變化

分別于術(shù)后14 d、25 d 處死2 只犬，氣管整體大體解剖觀察顯示損傷部位氣管外膜塌陷，軟骨支撐結(jié)構(gòu)破壞、塌陷，中間通過結(jié)締組織和肌性組織相連。 組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，術(shù)后14 d 氣管內(nèi)膜上皮不連續(xù)，多發(fā)潰瘍形成，其下腺體減少，黏膜中量肉芽組織增生（新生血管、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)），見重度炎癥浸潤(rùn)，伴少量纖維組織生長(zhǎng)；術(shù)后25 d 氣管軟骨變性吸收、部分被肉芽組織取代，黏膜下中度炎癥浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主，見多量纖維化，見圖4。

3 討論

為探尋氣管狹窄預(yù)防和治療的有效方法，構(gòu)建操作便捷、 可靠且重復(fù)性良好的氣管狹窄動(dòng)物模型顯得尤為重要。 正確選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模是獲得有效實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。 目前用于氣管狹窄實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物主要有犬、豬、兔等。 普通中型犬氣管長(zhǎng)徑、管腔內(nèi)徑均與人類相似［4］。 相較于兔等小型動(dòng)物，犬氣管內(nèi)徑寬，允許一定程度肉芽組織生長(zhǎng)，不僅便于氣管內(nèi)多種器械診療，還可為后期診療觀察創(chuàng)造時(shí)間與空間，有效增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性［5］。而且犬氣管后方膜部含肌層組織，可刺激收縮并促進(jìn)排痰，解剖學(xué)和生理學(xué)上最大程度接近于人類［6］。本研究選擇犬作為理想的氣管狹窄建模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

圖4 氣管狹窄組織病理學(xué)觀察結(jié)果（×40 倍光鏡下）

本研究采用支氣管鏡導(dǎo)引下圈套器電灼損傷氣管技術(shù)建模。 電圈套器在支氣管鏡導(dǎo)引進(jìn)入深部氣管，其電極呈橢圓形，可隨意控制工作電極長(zhǎng)度，在控制局部產(chǎn)熱的同時(shí)損傷范圍廣，達(dá)到損傷位置與程度俱佳效果。 研究表明犬氣管頸段全厚黏膜創(chuàng)面小于15 mm 時(shí)傷口愈合不會(huì)產(chǎn)生狹窄，只有創(chuàng)面寬度達(dá) 20～25 mm 時(shí)才會(huì)出現(xiàn)狹窄［7］。 本實(shí)驗(yàn)在操作過程中僅部分打開電圈套器，形成半橢圓形圈套環(huán)；為防止食管氣管瘺，實(shí)施損傷時(shí)避開后壁膜部，對(duì)前壁氣管軟骨環(huán)均勻分布的8 個(gè)定位點(diǎn)分別燒灼3 次，在確保有效損傷面積的同時(shí)通過接近于環(huán)形損傷創(chuàng)面，模擬臨床氣管插管后氣管狹窄。 氣管壁損傷深度與氣管狹窄密切相關(guān)，氣管黏膜和黏膜下層損傷僅會(huì)引起正常傷口愈合，對(duì)氣管軟骨和結(jié)締組織損傷則引起肉芽組織增生而非再生，從而導(dǎo)致氣管狹窄。 本實(shí)驗(yàn)方法既可保證氣管損傷深度，又避免單次高功率損傷貫穿氣管壁，造成氣胸后氣管塌陷等嚴(yán)重并發(fā)癥［8］。

本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示，術(shù)后14 d 損傷部位水腫和少量肉芽組織增生，21 d 時(shí)肉芽組織明顯增生，管腔明顯環(huán)形狹窄；與之對(duì)應(yīng)的是最遲于術(shù)后14 d、19 d 所有犬分別出現(xiàn)喘息和肋間隙凹陷，21 d、28 d氣管狹窄程度中位數(shù)分別達(dá)86%、90%。這與Su 等［9］犬氣管插管建模法拔管后14～21 d 出現(xiàn)肋間隙凹陷時(shí)間，21 d 時(shí)88%～93%狹窄結(jié)果相接近，與王超等［4］犬氣管支架置入14 d 后出現(xiàn)氣管狹窄也接近，由此反映本實(shí)驗(yàn)造模病理形成機(jī)制與臨床氣管插管和支架置入后狹窄機(jī)制相似。

近年來有研究報(bào)道采用電圈套器治療惡性中心氣管腫瘤，結(jié)果表明電圈套器在氣管內(nèi)應(yīng)用是安全、有效的［10］。電圈套器與電極相當(dāng)，有電氣化和電凝效果，對(duì)周圍組織損傷較少［8］。與機(jī)械損傷建模狹窄率低［11］、氣管插管建模耗時(shí)長(zhǎng)［8］相比，電損傷具有相對(duì)快速、精確，可定量損傷，并發(fā)癥少和重復(fù)性好的特點(diǎn)，可滿足氣管狹窄基礎(chǔ)研究構(gòu)建動(dòng)物模型需求。

由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較少，本研究?jī)H獲取2 只犬組織病理學(xué)標(biāo)本，但通過一般清況、支氣管鏡及CT 檢測(cè)觀察得出高度相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且相互驗(yàn)證，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了可靠依據(jù)。