涼血消銀顆粒劑對銀屑病轉(zhuǎn)基因小鼠模型miR-155/SOCS1軸的影響

段紫鈺，李建國，陳靜，劉鴻偉，李麗娜，周武，張守民

銀屑病俗稱牛皮癬，中醫(yī)學(xué)稱之為白疕，臨床表現(xiàn)為真皮炎性反應(yīng)、皮膚異常增殖、肉眼可見的紅斑脫屑等癥狀［1］。銀屑病一般多發(fā)于青壯年，全身各部位均可發(fā)病，具有病程長、易復(fù)發(fā)、治愈難等特點(diǎn)［2］。涼血消銀顆粒劑具有清熱涼血、活血化瘀、通絡(luò)、抗腫瘤、抗菌抗炎、增強(qiáng)免疫活性、抑制銀屑病表皮細(xì)胞增殖的功效［3］，但是其治療銀屑病的作用機(jī)制尚不明確。微小RNA-155（microRNA-155，miR-155）/細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）通路在多種疾病中發(fā)揮重要作用，miR-155與人體免疫系統(tǒng)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)miR-155在B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)中起促進(jìn)作用［4］。SOCS1是miR-155重要的靶基因，能夠負(fù)向調(diào)控Janus激酶（Janus kinase，Jak）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路［5-7］。涼血消銀顆粒劑能否通過調(diào)節(jié)miR-155/SOCS1軸以緩解銀屑病癥狀尚少見報道。本研究擬通過測定涼血消銀顆粒劑對轉(zhuǎn)基因銀屑病小鼠miR-155、SOCS1、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-23、IL-6、IL-1表達(dá)水平的影響，探究其治療銀屑病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器涼血消銀顆粒劑的組成成分為：紫草15 g、赤芍10 g、白花蛇舌草15 g、生地20 g、槐花15 g、丹參15 g、水牛角15 g、白茅根10 g、雞血藤15 g、丹皮10 g、熟地20 g，為我院中藥自制劑；甲氨蝶呤（＞98%）購自上海源葉生物科技有限公司，批號S18026；TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號E-EL-M0049c、E-EL-M0731c、EEL-M0044c、E-EL-M0038c；總RNA提取試劑盒購自北京金克隆生物科技有限公司，批號EX1882-50T；miR-155引物及內(nèi)參U6引物序列由北京安必奇生物科技有限公司合成；兔抗鼠SOCS1、兔抗鼠內(nèi)參β-actin、羊抗兔二抗均購自美國Bioworld公司，批號AC6015、AC5113、AC5719。電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽購自美國Bio-Rad公司；奧林巴斯CX33顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；Evolution 200紫外-可見分光光度計(jì)購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠（銀屑病模型，SPF級）24只，按隨機(jī)數(shù)表法分為模型組、涼血消銀顆粒劑組和甲氨蝶呤組，每組8只；未經(jīng)任何處理的遠(yuǎn)交系Swiss小鼠（FVB/NJ）8只（對照組），均購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（豫）2017-0001，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK（豫）2017-0012，動物質(zhì)量合格證號2018030912，全部小鼠雌雄各半，體質(zhì)量約25 g。隨機(jī)分籠飼養(yǎng)動物，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)并自由飲水，每隔3 d更換墊料，溫度設(shè)置為25℃，濕度（60±10）%。涼血消銀顆粒劑給藥時用生理鹽水稀釋，以60 g/kg劑量灌胃給藥（成人劑量的20倍），每日1次［3］；甲氨蝶呤以2 mg/kg劑量灌胃給藥，每日1次［8］；對照組、模型組每天灌胃等體積的生理鹽水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物取材各組小鼠給藥10 d在1%戊巴比妥鈉0.06 mL/g腹腔麻醉后，鼠尾采血，25℃靜置20 min后，5 000 r/min離心30 min，吸取上清液置于-80℃冰箱中保存。脫頸處死后立即剪取相應(yīng)受損處皮膚組織，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱儲存。

1.4 涼血消銀顆粒劑治療效果評價用嚴(yán)重程度指數(shù)（psoriasis area and severity index，PASI）評分評價涼血消銀顆粒劑的治療效果。使用照相機(jī)對各組小鼠同一病損皮膚部位進(jìn)行拍照觀察，按照PASI評分標(biāo)準(zhǔn)對小鼠進(jìn)行評分，PASI評分標(biāo)準(zhǔn)［9］：對小鼠病損皮膚部位的浸潤厚度、紅斑、鱗屑情況分別進(jìn)行0～4分賦值，小鼠的皮膚病損情況越嚴(yán)重，分值越高。

1.5 HE染色評價病理嚴(yán)重程度將固定后的各組小鼠受損皮膚組織石蠟包埋，切片（3μm左右）。將切片用二甲苯常規(guī)脫蠟，將脫蠟后的切片依次用二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水洗脫，然后脫水。蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化30 s，50℃溫水浸泡5 min，然后脫水。伊紅染色2 min，脫水、透明、中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達(dá)水平嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，顯色后，用多功能酶標(biāo)儀測定樣品在450 nm處的吸光度（A），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1水平。

1.7 實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測miR-155表達(dá)水平嚴(yán)格按照說明書提取皮膚組織總mRNA，使用紫外分光光度計(jì)測定mRNA在260/280 nm處紫外吸光度值，A260/280＞1.8表明純度合格，置于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆?。miR-155引物序列：上游5′-TTAATGCTAATTGTGATAGGGGT-3′，下 游5′-ACCCCTATCACAATTAGCATTAA-3′；內(nèi) 參U6上 游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。qPCR反應(yīng)體系20μL，其中SYBRPremix ExTaqTMⅡ10μL，cDNA 2 μL，Rox Re-ference DyeⅡ（50×）0.4μL，miR-155上、下游引物各0.8μL，ddH2O 6μL。采用兩步法，每個樣本均做6個復(fù)孔，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；94℃變性30 s，65℃退火30 s，75℃延伸15 s，40個循環(huán)；75℃終末延伸5 min。采用2-ΔΔCt法對miR-155水平定量分析。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）測定SOCS1蛋白表達(dá)水平從-80℃冰箱中取出待測樣品，加入200μL裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、苯甲基磺酰氟），勻漿至無組織碎塊，離心取上清。嚴(yán)格按照BCA試劑盒說明書測定總蛋白含量，每組設(shè)置6個復(fù)孔。加入樣品1/4體積的5×Loading buffer，加熱至100℃，持續(xù)5 min。穩(wěn)壓電泳（100 V），至樣品進(jìn)入分離膠，加大電壓至120 V，直至Loading buffer到達(dá)分離膠底部。濕法轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h。加入兔抗鼠SOCS1、兔抗鼠內(nèi)參β-actin，稀釋比例均為1∶1 000，4℃孵育過夜，用PBS清洗，加入羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育，PBS清洗，用顯色劑顯色、曝光。用凝膠成像設(shè)備觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0版軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示，多組比較行單因素方差分析，多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 涼血消銀顆粒劑治療后PASI評分對比4組間PASI評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68.062，P＜0.01，n=8）。與對照組（0）相比，模型組PASI評分顯著升高（3.25±0.26，P＜0.05）；與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組（2.13±0.24）、甲氨蝶呤組（1.88±0.25）PASI評分顯著降低（P＜0.05）；后兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 涼血消銀顆粒劑治療后HE染色結(jié)果對照組基底層細(xì)胞保持完整，血管周圍及真皮淺層未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組表現(xiàn)為棘層增厚、表皮突下延、角化過度伴角化不全、真皮淺層淋巴細(xì)胞浸潤，基本符合銀屑病病理特征；涼血消銀顆粒劑組和甲氨蝶呤組小鼠病理嚴(yán)重程度顯著降低，細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，見圖1。

Fig.1 HE staining results after treatment with Liangxue Xiaoyin granule in four groups(×200)圖1涼血消銀顆粒劑治療后各組HE染色結(jié)果（×200）

2.3 各組小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達(dá)水平與對照組相比，模型組TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組、甲氨蝶呤組TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；涼血消銀顆粒劑組與甲氨蝶呤組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of the expression levels of serum TNF-α,IL-23,IL-6 and IL-1 after treatment between four groups表1治療后各組小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達(dá)水平比較 （n=8，ng/L，±s）

Tab.1 Comparison of the expression levels of serum TNF-α,IL-23,IL-6 and IL-1 after treatment between four groups表1治療后各組小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達(dá)水平比較 （n=8，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組涼血消銀顆粒劑組甲氨蝶呤組F TNF-α 87.29±12.34 164.65±14.07a 113.29±11.19ab IL-23 85.39±8.41 181.94±17.62a 114.87±15.93ab IL-6 55.95±15.26 126.82±17.95a 75.33±14.42b IL-1 35.97±8.14 81.49±10.26a 64.77±10.39ab 108.13±8.97ab 62.138＊＊122.08±10.94ab 69.510＊＊73.18±13.91b 31.304＊＊60.08±10.45ab 29.109＊＊

2.4 治療后小鼠受損皮膚組織中miR-155、SOCS1表達(dá)水平與對照組相比，模型組miR-155表達(dá)水平顯著升高，SOCS1表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組、甲氨蝶呤組miR-155表達(dá)水平顯著降低，SOCS1表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；后兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表2。

Fig.2 The expression of SOCS1 in the damaged skin tissue detected by Western blot assay in four groups圖2 Western blot檢測各組小鼠受損皮膚組織中SOCS1表達(dá)水平

Tab.2 Comparison of miR-155 and SOCS1 expression levels in damaged skin tissues after treatment between four groups表2治療后各組小鼠受損皮膚組織中miR-155、SOCS1表達(dá)水平比較 （n=8，±s）

Tab.2 Comparison of miR-155 and SOCS1 expression levels in damaged skin tissues after treatment between four groups表2治療后各組小鼠受損皮膚組織中miR-155、SOCS1表達(dá)水平比較 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組涼血消銀顆粒劑組甲氨蝶呤組F miR-155/U6 1.09±0.34 1.84±0.43a 1.36±0.22b 1.33±0.19b 8.204＊＊SOCS1/β-actin 0.80±0.21 0.28±0.06a 0.47±0.09ab 0.46±0.11ab 22.131＊＊

3 討論

3.1 涼血消銀顆粒劑治療銀屑病的研究現(xiàn)狀銀屑病病因復(fù)雜，其與感染、遺傳、代謝、環(huán)境、免疫功能、精神和內(nèi)分泌因素等有關(guān)［10］。甲氨蝶呤是臨床上治療銀屑病的常用藥，主要針對癥狀進(jìn)行治療，可減緩患者臨床表現(xiàn)，但是在用藥過程中存在并發(fā)癥［11］。

中醫(yī)理論認(rèn)為，銀屑病患者化燥生風(fēng)、營血虧損、肌膚失養(yǎng)、血熱內(nèi)蘊(yùn)等引起，反映在患者的肌膚中就是血瘀、血燥、血熱［12］。從血論治是中醫(yī)界較為認(rèn)可的治療銀屑病一種觀點(diǎn)，涼血消銀顆粒劑以生地為君藥，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的作用，水牛角、槐花、紫草為臣藥以增強(qiáng)清熱涼血功效［13］。曹麗楠［14］研究發(fā)現(xiàn)涼血消銀湯能夠改善進(jìn)行期銀屑病患者臨床癥狀，降低血清中IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平，提高臨床療效。孫濤［3］發(fā)現(xiàn)涼血消銀顆粒治療的銀屑病患者有效率高，2年復(fù)發(fā)率低，提示使用涼血消銀顆粒治療臨床效果好，能降低復(fù)發(fā)率。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組PASI評分顯著升高，棘層增厚、表皮突下延、角化過度伴角化不全、真皮淺層淋巴細(xì)胞浸潤，即提示浸潤厚度、紅斑、鱗屑加重，證明模型制備成功。與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組、甲氨蝶呤組PASI評分顯著降低，病理嚴(yán)重程度顯著降低，細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，提示涼血消銀顆粒劑治療能夠緩解銀屑病癥狀，對銀屑病有較好的治療效果，與臨床常用藥甲氨蝶呤相當(dāng)，表明涼血消銀顆粒劑有望成為臨床上治療銀屑病備選藥物。

3.2 涼血消銀顆粒劑對銀屑病小鼠炎癥反應(yīng)的影響銀屑病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，炎癥因子發(fā)揮重要作用，IL-6一般由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌，有助于角質(zhì)細(xì)胞增生，促進(jìn)銀屑病發(fā)展，與其嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［15］。IL-1能夠活化B細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞且能夠介導(dǎo)體液免疫，銀屑病患者血清中IL-1水平明顯高于健康人群，提示IL-1水平與銀屑病發(fā)生發(fā)展相關(guān)［16］。IL-23是促炎性細(xì)胞因子，參與機(jī)體自身免疫疾病和控制感染，在銀屑病患者血清中高表達(dá)，與銀屑病發(fā)病相關(guān)［17］。TNF-α能夠參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增生，其水平與銀屑病患者皮損面積呈正相關(guān)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠血清TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達(dá)水平顯著升高，提示銀屑病的發(fā)生伴隨細(xì)胞炎癥因子過表達(dá)；與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組、甲氨蝶呤組TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達(dá)水平顯著降低，涼血消銀顆粒劑組與甲氨蝶呤組相比無差異，提示經(jīng)治療后細(xì)胞炎癥因子水平下降，銀屑病小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)得到緩解，但是涼血消銀顆粒劑通過何種通路下調(diào)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平還有待進(jìn)一步研究。

3.3 涼血消銀顆粒劑對銀屑病小鼠miR-155/SOCS1信號通路的影響銀屑病的發(fā)病過程涉及多種信號通路參與，研究發(fā)現(xiàn)異丙酚能夠抑制miR-155表達(dá)水平，上調(diào)SOCS1水平來減輕小膠質(zhì)細(xì)胞對脂多糖（LPS）的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，提示異丙酚可能通過miR-155/SOCS1信號通路下調(diào)細(xì)胞炎癥因子水平，緩解炎癥反應(yīng)［19］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)miR-155能夠促進(jìn)吸血蟲感染早期炎癥反應(yīng)，通過負(fù)調(diào)控SOCS1水平參與吸血蟲感染患者病情的進(jìn)展［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組miR-155表達(dá)水平顯著升高，SOCS1表達(dá)水平顯著降低，提示miR-155/SOCS1信號通路可能參與銀屑病小鼠炎癥反應(yīng)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組、甲氨蝶呤組miR-155表達(dá)水平顯著降低，SOCS1表達(dá)水平顯著升高，涼血消銀顆粒劑組與甲氨蝶呤組相比無差異，提示涼血消銀顆粒劑能夠下調(diào)miR-155表達(dá)水平、上調(diào)SOCS1表達(dá)水平，可能通過抑制miR-155/SOCS1軸活化而緩解銀屑病小鼠病癥。

綜上所述，涼血消銀顆粒劑可能通過抑制miR-155/SOCS1軸活化，降低炎癥反應(yīng)，進(jìn)而緩解銀屑病小鼠病癥，推測其有望成為臨床上治療銀屑病的備選藥。但是，由于本研究樣本量較小，且并不能完全代表人類銀屑病的發(fā)病過程，因此需要擴(kuò)大樣本量并從細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證。