mRNA和ncRNA在死亡時(shí)間推斷中的研究進(jìn)展

呂葉輝 ，王卓群 ，陳憶九 ，陳龍

（1.上海健康醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201318；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；3.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032）

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI），又稱死后間隔時(shí)間或死后經(jīng)歷時(shí)間，通常是指發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時(shí)距死亡發(fā)生時(shí)的時(shí)間間隔。對(duì)于刑事案件，PMI的準(zhǔn)確推斷可為偵查部門提供重要線索，有助于劃定偵查范圍、確定案件性質(zhì)以及認(rèn)定和排除嫌疑人等。對(duì)于死亡糾紛涉及仲裁、財(cái)產(chǎn)繼承以及保險(xiǎn)理賠的民事案件，PMI的準(zhǔn)確推斷亦可為司法實(shí)踐提供重要的科學(xué)依據(jù)。因此，PMI的準(zhǔn)確推斷一直是法醫(yī)學(xué)研究和實(shí)踐的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

PMI推斷的方法較多，傳統(tǒng)的方法如尸體現(xiàn)象（尸斑、尸冷及角膜變化等）、胃內(nèi)容物消化過程、膀胱尿量、尸體周圍植物生長變化規(guī)律及昆蟲發(fā)育情況等[1]，可簡單快速推斷PMI，但由于體外環(huán)境因素的復(fù)雜性和多變性，推斷誤差較大，易受主觀經(jīng)驗(yàn)的影響，難以滿足法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中復(fù)雜多變的需求。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展及相關(guān)研究技術(shù)的進(jìn)步，許多學(xué)者通過檢測死后機(jī)體生物分子物質(zhì)［如脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）[2-3]、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）[4-7]和蛋白質(zhì)[8-9]等］的降解變化規(guī)律來推斷PMI，取得了一系列研究成果。隨著這些生物分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)、種類和生物學(xué)特性被不斷揭示，RNA在PMI推斷中的應(yīng)用價(jià)值得到深入挖掘，逐漸成為研究熱點(diǎn)。本文綜述了近20年來運(yùn)用信使RNA（messenger RNA，mRNA）和非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）進(jìn)行PMI推斷的研究進(jìn)展，并探討了存在的問題及發(fā)展趨勢，以期為相關(guān)研究和鑒定實(shí)踐提供技術(shù)參考。

1 運(yùn)用mRNA死后變化規(guī)律推斷PMI

1.1 運(yùn)用mRNA死后變化規(guī)律推斷PMI的早期探索（2002—2009年相關(guān)研究）

2002年，INOUE等[10]首先探討了mRNA作為PMI推斷指標(biāo)的可能性，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)檢測了大鼠腦組織中甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）在死后7 d內(nèi)的循環(huán)定量（quantification cycle，Cq）值［也稱循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）］，發(fā)現(xiàn)其與PMI之間存在良好的線性規(guī)律。2003年，BAUER 等[11]設(shè)計(jì)了 5′端到 3′端4個(gè)不同長度的脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）擴(kuò)增產(chǎn)物（FAS1～4），用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)檢測不同片段的含量，發(fā)現(xiàn)5′端片段的降解速率快于3′端；研究人員認(rèn)為死后組織RNA的降解具有方向性，可依次選取合適片段作為PMI推斷的指標(biāo)。2004年，KOZHEMYAKO等[12]通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在人體肝腎組織中僅死后3d內(nèi)可檢測到，而在腦組織中7d內(nèi)都可檢測到。同年，OHASHI等[13]運(yùn)用qRT-PCR檢測了乳腺組織中β-actin、GAPDH、核糖體磷蛋白大亞基P0（ribosomal phosphoprotein large P0，RPLP0）以及Sma和Mad相關(guān)蛋白2（Sma-and Madrelated protein 2，Smad2）的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)上述管家基因在不同離體時(shí)間（10 min～3 h）樣本中并無差異，從而得出了組織離體3 h內(nèi)并無RNA損失及mRNA降解的結(jié)論。然而，GEHEEB等[14]在2005年發(fā)表評(píng)論文章，認(rèn)為該論文作者錯(cuò)誤理解了qRT-PCR的數(shù)據(jù)，上述結(jié)果可能是部分管家基因在死后早期轉(zhuǎn)錄活性增加和mRNA時(shí)序性降解共同作用導(dǎo)致的。

2006年，ZHAO等[15]運(yùn)用Taqman探針法檢測了紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）和GAPDH在尸體心、腦、腎和肺組織中的含量，以GAPDH為內(nèi)參，EPO的相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCq）在各組織中均隨PMI延長顯著上升。作者雖未明確解釋EPO為何呈時(shí)序上升趨勢，但其所用的探針和引物序列是人屬特異性的，排除了死后機(jī)體微生物的影響。2007年，HEINRICH等[16]收集了不同PMI（15～118h）的尸檢組織，并設(shè)計(jì)了不同擴(kuò)增片段長度的GAPDH引物（GAPDH F1～F5，114～866 bp），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與肝、脾和腎組織相比，心、腦和骨骼肌組織中GAPDH的降解較為緩慢，甚至擴(kuò)增片段最長的GAPDH F5都能在大部分腦和骨骼肌樣本中檢出。此外，文章作者詳細(xì)討論了不同擴(kuò)增片段長度對(duì)定量的影響，認(rèn)為在研究死后mRNA的穩(wěn)定性時(shí)，應(yīng)盡量選擇小于150bp的擴(kuò)增產(chǎn)物長度。同年，BAUER[4]發(fā)表重要綜述，詳細(xì)討論了RNA在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景，并總結(jié)性提出死后機(jī)體內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性受眾多因素的影響，如組織類型、環(huán)境溫度及死前狀態(tài)等。

與此同時(shí)，國內(nèi)學(xué)者也開展了運(yùn)用mRNA進(jìn)行PMI推斷的研究，所選擇的指標(biāo)主要是管家基因mRNA，特別是β-actin和GAPDH。2005年，肖俊輝等[17-18]運(yùn)用RT-PCR和凝膠圖像分析技術(shù)對(duì)斷頸死大鼠進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)骨骼肌組織中β-actin在死后6d內(nèi)可檢測到，而心肌和肺組織中β-actin于死后12d仍可檢出。2006年，梁贊姜等[19]運(yùn)用同樣辦法，檢測了麻醉死大鼠各組織中β-actin的最長檢出時(shí)限，發(fā)現(xiàn)肝組織為死后4d，腎組織為8d，心肌組織為10d，而脾組織為12d。同年，朱方成等[20]運(yùn)用復(fù)合熒光RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在死后32 h內(nèi)大鼠腎和脾組織中可檢測到GAPDH mRNA，且表達(dá)產(chǎn)物含量（熒光強(qiáng)度）隨PMI呈規(guī)律性下降趨勢。但是，上述研究只進(jìn)行了相關(guān)指標(biāo)的半定量或定量分析，并未嘗試建立方程進(jìn)行PMI推斷。

2007年，劉季等[21]用RT-PCR檢測了窒息死大鼠腦組織中GAPDH的含量，發(fā)現(xiàn)其在2d內(nèi)含量下降不明顯，但在3～7d降解顯著增加，且降解速度隨溫度升高而增加。同年，陳曉瑞等[22]運(yùn)用復(fù)合熒光RT-PCR檢測了大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)β-actin、磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase 1，PGK1）和核糖體蛋白L4（ribosomal protein L4，RPL4）的死后降解變化情況，并建立了線性方程推斷PMI。2008年，朱方成等[23]也運(yùn)用上述技術(shù)建立了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT）含量與PMI（0～36 h）的線性回歸方程，認(rèn)為HGPRT在大鼠腎組織中的檢測時(shí)限比之前報(bào)道[20]的GAPDH更短，更適合進(jìn)行早期PMI的推斷。

2009年，任廣睦等[24]先運(yùn)用RT-PCR和凝膠圖像分析技術(shù)定性分析了大鼠7個(gè)組織中GAPDH和β-actin的表達(dá)情況，在脾、腦組織中死后5 d內(nèi)可檢出，在心、腎組織中死后3d內(nèi)可檢出，而在肝、肺組織中僅死后1d內(nèi)可檢出。與INOUE等[10]和肖俊輝等[17]的研究相比，該研究存在管家基因mRNA檢出時(shí)限縮短的現(xiàn)象，作者分析原因一是環(huán)境濕度較高使mRNA降解加速，二是RT-PCR敏感性較低。同年，任廣睦等[25]運(yùn)用更高效、敏感的qRT-PCR技術(shù)對(duì)大鼠腦和脾組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)GAPDH和β-actin在死后12d內(nèi)均有Cq值被檢出，且與PMI具有顯著的線性關(guān)系。之后，任廣睦等[26]又用該技術(shù)系統(tǒng)分析了大鼠死后12 d內(nèi)腦組織中GAPDH多個(gè)位點(diǎn)片段（5′端到3′端6個(gè)片段，GAPDH1～6）的含量與中晚期PMI的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)靠近5′端的3個(gè)片段降解速率相近，均快于靠近3′端的3個(gè)片段，該研究進(jìn)一步完善了BAUER等[11]的mRNA死后降解方向的假說，認(rèn)為可選擇更靠近3′端的片段作為晚期PMI推斷的指標(biāo)，并提出了引物序列標(biāo)準(zhǔn)化的想法。

由于自然界中和生物體內(nèi)均存在大量的RNA酶，以往學(xué)者認(rèn)為RNA的穩(wěn)定性較差，不適合作為PMI推斷的指標(biāo)。但隨著研究的深入，國內(nèi)外學(xué)者逐漸發(fā)現(xiàn)死后機(jī)體內(nèi)RNA的降解變化規(guī)律具有時(shí)序性，可通過測定某些常見的管家基因mRNA（特別是GAPDH和β-actin）的含量變化推斷PMI。學(xué)者們?cè)?010年前的研究就顯示mRNA的時(shí)序性降解受到較多因素的影響，如環(huán)境溫度、濕度、死亡原因、生前影響因素和組織類型等，還有部分學(xué)者[11，26]探討了死后mRNA降解方向的問題，認(rèn)為mRNA的死后降解是從5′端到3′端，可選取靠近5′端片段作為早期PMI推斷的指標(biāo)，3′端片段作為中晚期PMI推斷的指標(biāo)。另外，也有學(xué)者[16]探討了擴(kuò)增片段長度對(duì)mRNA定量的影響，初步提出了引物序列位置和長度標(biāo)準(zhǔn)化的想法。

運(yùn)用RNA降解規(guī)律推斷PMI的定量方法也有明顯進(jìn)步，以往的半定量RT-PCR檢測靈敏度相對(duì)較低，這也是諸多早期研究[10，17，20，23-24]中同一 mRNA 指標(biāo)檢出時(shí)限不同的原因之一，而更為靈敏的qRT-PCR顯著推動(dòng)了該研究領(lǐng)域的進(jìn)步，是研究死后mRNA時(shí)序性變化的可靠工具。但是，和國外研究相比，國內(nèi)2009年以前的研究材料均為大鼠樣本，缺少對(duì)其他動(dòng)物模型和人體樣本的探索和驗(yàn)證。此外，雖然國內(nèi)外相關(guān)研究的推斷指標(biāo)主要為管家基因mRNA，特別是GAPDH和β-actin，但由于PMI間隔（或節(jié)點(diǎn)）的設(shè)置缺少標(biāo)準(zhǔn)，以致早期或中晚期PMI階段GAPDH和β-actin的時(shí)序性變化規(guī)律并未得到明確，還需進(jìn)一步研究。

1.2 近10年運(yùn)用mRNA死后變化規(guī)律推斷PMI的研究進(jìn)展（2010—2019年相關(guān)研究）

近10年來，隨著RNA研究技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)RNA（特別是ncRNA）認(rèn)識(shí)的不斷提高，單純運(yùn)用mRNA死后變化規(guī)律推斷PMI的相關(guān)研究主要集中在2013年前和2017年后，共計(jì)23項(xiàng)[27-49]，詳見附表1。

1.2.1 運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)檢測mRNA死后變化規(guī)律推斷PMI的研究進(jìn)展

在上述23項(xiàng)研究中，運(yùn)用RT-PCR或qRT-PCR驗(yàn)證單個(gè)或多個(gè)mRNA指標(biāo)時(shí)序性變化規(guī)律進(jìn)行PMI推斷的研究有 15 項(xiàng)[27，31-36，38-41，46-49]。2010 年，PARTEMI等[27]收集了16例人體心肌樣本，并分為長PMI組（36～120 h）和短PMI組（0.6～2.7 h），但在4個(gè)候選mRNA指標(biāo)中，只有內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）在兩組的表達(dá)具有差異。2011年，KIMURA等[31]檢測了小鼠和人體3個(gè)組織中節(jié)律基因的表達(dá)情況，分別證實(shí)PER2/BMAL1和NR1D1/BMAL1含量比值在24h內(nèi)呈節(jié)律性變化，為PMI推斷提供了新思路。2010—2011年，國內(nèi)學(xué)者[28-29，32]也延續(xù)了之前的研究[17-22]，在大鼠或小鼠模型中運(yùn)用RT-PCR或qRT-PCR檢測管家基因mRNA的時(shí)序性降解規(guī)律，但均缺乏對(duì)內(nèi)參指標(biāo)（內(nèi)參基因）的考量與篩選。

2013年，SAMPAIO-SILVA等[33]在0～11 h連續(xù)取材3種小鼠組織，發(fā)現(xiàn)骨骼肌和肝組織中6個(gè)mRNA的Cq值均與PMI顯著相關(guān)，并建立了基于線性回歸的數(shù)學(xué)模型推斷早期PMI；該研究的創(chuàng)新之處是預(yù)留了額外樣本進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證樣本的推斷誤差在1h左右。同年，YOUNG等[34]嘗試使用豬牙髓RNA進(jìn)行晚期PMI推斷，發(fā)現(xiàn)較短片段的β-actin在死后84 d內(nèi)的含量變化與PMI具有相關(guān)性。DENG等[35]也做了積極嘗試，將DNA作為內(nèi)參，檢測了不同環(huán)境溫度下缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和β-actin在心腦組織中的時(shí)序性變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4℃組含量變化不明顯，而37℃組各RNA含量在24 h內(nèi)明顯下降。2014年，ZAPICO等[36]研究了細(xì)胞死亡蛋白相關(guān)基因FsaL和PTEN，發(fā)現(xiàn)上述指標(biāo)在死后6h內(nèi)表達(dá)上升，與PMI有良好的線性關(guān)系，但在8h又開始下降。該研究得出了機(jī)體死后部分基因轉(zhuǎn)錄活性增加和mRNA時(shí)序性降解的結(jié)論，但時(shí)間節(jié)點(diǎn)的推論還需進(jìn)一步證實(shí)。

2017年，劉志杰等[38]以次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT）為內(nèi)參，發(fā)現(xiàn)腦組織中核糖體蛋白L32（ribosomal protein L32，RPL32）等指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量與PMI存在線性關(guān)系。同年，ALI等[39]收集了人體皮膚組織并檢測了晚期角質(zhì)化包膜蛋白1C（late cornified envelope 1C，LCE1C）隨 PMI（0～5 d）的變化情況，發(fā)現(xiàn) LCE1C在不同溫度組均隨PMI延長而逐漸降低。BAI等[40]延續(xù)了DENG等[35]的研究，以caspase-3 DNA為內(nèi)參，證實(shí)缺氧相關(guān)因子（hypoxia associated factor，HAF）在48h內(nèi)的表達(dá)量隨PMI延長而上升，且在0.5～4h有更好的相關(guān)性。ELGHAMRY等[41]將大鼠斷頸處死后，將尸體分別暴露于空氣（30℃）、埋入沙地（30℃）和淹沒入水（6℃和30℃）4種環(huán)境中長達(dá)96h，檢測發(fā)現(xiàn)腦組織中GAPDH的含量變化和PMI、存放條件及環(huán)境溫度均密切相關(guān)。2018年，F(xiàn)AIS等[46]收集了10例尸檢牙齦組織，分為死后1～3d、4～5d和8～9d 3個(gè)研究組，并以3例手術(shù)牙齦組織為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尸檢組織中HIF-1α的含量隨PMI延長而逐漸降低，但死后1～3d和4～5d組中HIF-1α的含量均高于對(duì)照組，分析是死亡前的缺氧過程使HIF-1α的表達(dá)增加，之后又隨PMI延長不斷降解。

作為研究RNA表達(dá)的精確定量技術(shù)，qRT-PCR具有準(zhǔn)確高效的優(yōu)點(diǎn)，但其結(jié)果的準(zhǔn)確性很大程度上依賴于穩(wěn)定內(nèi)參指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化。在上述15項(xiàng)研究中，有11項(xiàng)都使用了內(nèi)參指標(biāo)校正，除2項(xiàng)[35，40]使用了DNA進(jìn)行校正，其余9 項(xiàng)中有5 項(xiàng)[31，36，39，46，49]均使用了 GAPDH或β-actin作為內(nèi)參指標(biāo)。但是，KOPPELKAMM等[50]認(rèn)為，死后機(jī)體內(nèi)理想的內(nèi)參指標(biāo)應(yīng)該較少受PMI、外界環(huán)境、組織類型、死亡原因和死前因素的影響，而一般分子生物學(xué)研究中常用的GAPDH和β-actin并不滿足上述條件，除時(shí)序性降解外，GAPDH還被證明在缺氧、窒息條件下表達(dá)上調(diào)[51-52]，故不適合作為PMI推斷研究中的內(nèi)參指標(biāo)。鑒于死后組織樣本的特殊性，穩(wěn)定適用的內(nèi)參指標(biāo)在一定程度上可以消除個(gè)體差異和環(huán)境因素的影響，故PMI推斷研究的內(nèi)參指標(biāo)篩選和驗(yàn)證需要學(xué)者進(jìn)一步關(guān)注。當(dāng)然，在上述研究中，也有部分研究人員[33，47-48]按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR國際化標(biāo)準(zhǔn)暨M(jìn)IQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-time PCR Experiments）指南[53]要求，提供了包括樣本分析、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、靶基因信息、qPCR引物或探針、qPCR實(shí)驗(yàn)流程、qPCR合理性驗(yàn)證和數(shù)據(jù)分析在內(nèi)的系列實(shí)驗(yàn)信息，此舉不僅使相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作更加規(guī)范，也提升了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

1.2.2 運(yùn)用高通量技術(shù)檢測mRNA死后變化規(guī)律推斷PMI的研究進(jìn)展

近幾年來，也有學(xué)者開始通過生物信息學(xué)分析RNA測序數(shù)據(jù)，在PMI推斷研究中取得了一些進(jìn)展。2015年，F(xiàn)ENG等[37]分析了部分基因型-組織表達(dá)（Genotype-Tissue Expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫 RNA 測序數(shù)據(jù)，提出mRNA完整性指數(shù)（mRNA integrity number，mRIN）的概念，用來評(píng)估測序樣本中mRNA的降解程度。2017年，ZHU等[42]系統(tǒng)性分析了GTEx數(shù)據(jù)庫中2016個(gè)測序樣本的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PMI相關(guān)性基因的整體表達(dá)模式具有組織特異性，并篩選出266個(gè)差異表達(dá)基因，其中206個(gè)基因隨PMI延長而下調(diào)。2018年，F(xiàn)ERREIRA等[45]進(jìn)一步分析了GTEx數(shù)據(jù)庫中36種組織共7105個(gè)樣本的RNA測序數(shù)據(jù)，篩選出187個(gè)至少在3種組織中都與PMI相關(guān)的mRNA指標(biāo)，并通過梯度提升樹建立了數(shù)學(xué)模型推斷PMI，較低推斷誤差（均值9.45min，中位數(shù)63.75min）也證實(shí)了多組織、多指標(biāo)模型的有效性。上述對(duì)RNA測序數(shù)據(jù)分析的研究證實(shí)，雖然死后組織內(nèi)mRNA的表達(dá)變化受多種因素（PMI、死亡原因、缺血、窒息等死前狀態(tài)）影響，但生物信息學(xué)分析、大數(shù)據(jù)工具運(yùn)用和數(shù)學(xué)模型創(chuàng)新為運(yùn)用RNA進(jìn)行PMI推斷提供了一種新的思路和方法。

運(yùn)用表達(dá)譜芯片進(jìn)行PMI推斷的報(bào)道也逐年增多。2011年，BIRDSILL等[30]檢測了79例人體大腦皮質(zhì)樣本的總RNA，發(fā)現(xiàn)RNA完整性指數(shù)（RNA integrity number，RIN）與PMI呈負(fù)相關(guān)，并通過PCR芯片檢測了89個(gè)基因在早期PMI樣本中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其中65個(gè)mRNA指標(biāo)在機(jī)體死后含量逐漸下降，而20個(gè)mRNA指標(biāo)的含量隨PMI延長而增加。2017年，HUNTER等[43]和POZHITKOV等[44]運(yùn)用表達(dá)譜芯片檢測了斑馬魚和小鼠多個(gè)mRNA的表達(dá)情況，通過基因計(jì)量方法挑選出斑馬魚中548個(gè)和小鼠中515個(gè)死后表達(dá)上調(diào)指標(biāo)，并通過矩陣代數(shù)綜合多個(gè)指標(biāo)構(gòu)建數(shù)學(xué)模型進(jìn)行PMI推斷，額外樣本驗(yàn)證結(jié)果顯示，推斷誤差在斑馬魚中<3h，在小鼠肝組織中<4h，在小鼠腦組織中<5h。2018年，TAO等[47]通過mRNA表達(dá)譜芯片在大鼠心肌中篩選出217個(gè)差異表達(dá)mRNA指標(biāo)，其中31個(gè)與凋亡、自溶等信號(hào)通路有關(guān)，特別是細(xì)胞分裂周期蛋白25B（cell division cycle protein 25B，CDC25B）與早期PMI的相關(guān)性較好，依此建立了多溫度數(shù)學(xué)模型推斷PMI，驗(yàn)證結(jié)果表明，誤差率相對(duì)較低（10%左右）。2019年，WANG等[48]延續(xù)了TAO等[47]的研究，運(yùn)用表達(dá)譜芯片篩選了一批大鼠腦組織早期PMI相關(guān)性mRNA指標(biāo)，并運(yùn)用其中6個(gè)指標(biāo)（NINJ2、GRIFIN、ARPP19、HOPX、SYNPR和SYNPO2）建立了多溫度數(shù)學(xué)模型推斷PMI，驗(yàn)證結(jié)果表明，前4個(gè)指標(biāo)建立的數(shù)學(xué)模型誤差率較低（<3h），通過聯(lián)用多個(gè)數(shù)學(xué)模型推斷PMI，可進(jìn)一步降低推斷誤差（<1.5h）。

近幾年來，通過分析RNA測序數(shù)據(jù)和運(yùn)用高通量芯片技術(shù)進(jìn)行PMI推斷的研究中，其共同特點(diǎn)是樣本多、組織多、指標(biāo)多、數(shù)據(jù)量大，所以需要更加先進(jìn)的算法（如聚類、矩陣代數(shù)、梯度提升樹和機(jī)器學(xué)習(xí)等）提供相關(guān)支持。在數(shù)學(xué)模型優(yōu)化的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證結(jié)果也證實(shí)研究所建立的綜合性（多組織、多指標(biāo)）數(shù)學(xué)模型的推斷精度較高，是未來的研究方向之一，但這些研究的缺點(diǎn)是數(shù)據(jù)處理比較復(fù)雜、費(fèi)用比較昂貴，所以如何應(yīng)用到實(shí)際工作中還需進(jìn)一步研究。

在2010年前的相關(guān)研究中，各學(xué)者選擇的mRNA指標(biāo)相對(duì)單一，過于依賴前期研究或文獻(xiàn)篩選，主要為GAPDH、β-actin等管家基因或EPO、iNOS等單個(gè)候選基因，所選用的數(shù)學(xué)模型也較為簡單，僅為線性回歸模型，一定程度上也影響了PMI推斷的精確性。隨著研究的深入，mRNA指標(biāo)的選擇更加多元，在近10年的研究中絕大多數(shù)的候選mRNA指標(biāo)數(shù)量超過3個(gè)。值得一提的是，指標(biāo)的篩選也更加依賴轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)技術(shù)手段，運(yùn)用高通量方法（RNA測序或表達(dá)譜芯片）篩選與細(xì)胞死后變化相關(guān)的mRNA（如ARPP19、HPOX和PTEN等）進(jìn)行PMI推斷成為新熱點(diǎn)，因其可聯(lián)合功能學(xué)分析，有望闡明特定指標(biāo)時(shí)序性變化的機(jī)制，為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中準(zhǔn)確推斷PMI提供理論基礎(chǔ)。

2 運(yùn)用ncRNA死后變化規(guī)律推斷PMI

ncRNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小 RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）等，上述ncRNA都是細(xì)胞生命活動(dòng)中的重要組成部分，又被稱為管家 ncRNA（housekeeping ncRNA）[54]。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，尤其是高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，更多種類的ncRNA被發(fā)現(xiàn)，其調(diào)控機(jī)制也逐漸被揭示，其在許多重要的生物進(jìn)程中都發(fā)揮著重要的作用，逐漸成為各相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。其中，常見的具有調(diào)控作用的調(diào)控ncRNA（regulatory ncRNA）包括微小 RNA（microRNA，miRNA）、長鏈ncRNA（long ncRNA，lncRNA）和環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）等。

2.1 運(yùn)用管家ncRNA進(jìn)行PMI推斷的相關(guān)研究

運(yùn)用管家ncRNA死后變化規(guī)律推斷PMI的研究主要集中在2010年以后。2010年以前用于PMI推斷的ncRNA主要是rRNA，且多數(shù)研究僅將rRNA作為候選內(nèi)參指標(biāo)，或與mRNA的降解規(guī)律進(jìn)行橫向?qū)Ρ取?/p>

早在1991年，NOGUCHI等[55]比較了大鼠腦組織中精氨酸加壓素（arginine vasopressin，AVP）mRNA和18S rRNA的含量，發(fā)現(xiàn)死后24h內(nèi)，AVP的降解速率明顯快于18S rRNA。1994年，PARDUE等[56]比較了大鼠腦組織中熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）mRNA和18S rRNA的含量，得出了類似的結(jié)論。2007年，劉季等[21]比較了GAPDH和18S rRNA的降解規(guī)律，發(fā)現(xiàn)18S rRNA降解緩慢，在死后7d仍具有良好的穩(wěn)定性。上述研究結(jié)果均表明，在死亡早期一段時(shí)間內(nèi)，18S rRNA的穩(wěn)定性高于其他mRNA指標(biāo)，故其經(jīng)常被用作內(nèi)參指標(biāo)[57-60]或候選內(nèi)參指標(biāo)[50，61-62]。2010年，李文燦等[63]提出了不同看法，其發(fā)現(xiàn)大鼠心肌組織中18S rRNA的含量在死后96h內(nèi)逐漸增多，之后才開始下降，推測是18S rRNA存在于核糖核蛋白復(fù)合體中，蛋白質(zhì)時(shí)序性降解使rRNA從復(fù)合體中釋放出來，導(dǎo)致18S rRNA含量在死后一段時(shí)間內(nèi)上升，此報(bào)道結(jié)果與IWAMOTO等[64]對(duì)rRNA不同亞基的研究結(jié)果類似，但均需進(jìn)一步證實(shí)。

2011年，朱怡等[58]檢測了不同溫度小鼠腦組織中βactin和18S rRNA的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)β-actin與18S rRNA含量的比值呈時(shí)序性下降。同年，VAN DOORN等[59]證實(shí)18S rRNA在死后15d的家兔骨髓組織中也可通過qRT-PCR檢出。2013年，任廣睦等[65]研究了尸檢肌肉組織（存放至10d）中不同rRNA亞基（5S rRNA、5.8S rRNA、18 rRNA和28S rRNA）的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)各rRNA在死后一定時(shí)間內(nèi)無顯著性降解，可作為中晚期PMI推斷的內(nèi)參指標(biāo)。2015年，尹長玉等[66]延續(xù)了上述研究，發(fā)現(xiàn)腦組織各亞基的表達(dá)量差異僅在0 d和10d具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，脾組織各亞基的表達(dá)量既和PMI有關(guān)，也和年齡有關(guān)。2016年，POóR等[67]完善了YOUNG等[34]的研究，比較了牙髓（放置至121d）中不同片段（800、400和200bp）的β-actin和28S rRNA的含量變化，qRT-PCR結(jié)果表明，28S rRNA的檢出時(shí)間明顯長于β-actin，其中200 bp的β-actin可在29 d內(nèi)檢出，而200 bp的28S rRNA可在45 d內(nèi)檢出。同年，姜竹青等[68]證實(shí)小鼠肝組織中18S rRNA的死后降解速率隨溫度升高而加速，并通過插值分析建立了Cq值、PMI和環(huán)境溫度的多元數(shù)學(xué)模型進(jìn)行PMI推斷。

2017年，KIM等[69]設(shè)計(jì)了兩個(gè)不同位點(diǎn)的28S rRNA片段，一個(gè)是5′端片段，一個(gè)是包含細(xì)胞死亡相關(guān)裂解位點(diǎn)（cell death-related cleavage sites）的D8可變區(qū)片段，qRT-PCR結(jié)果表明，5′端片段在死后心腦組織中均非常穩(wěn)定，甚至有表達(dá)上調(diào)趨勢，而D8可變區(qū)片段含量在死后72h快速下降，兩者含量的比值和PMI呈良好的線性關(guān)系。上述不同位點(diǎn)的定量結(jié)果可在一定程度上解釋多個(gè)研究中28S rRNA和18S rRNA降解規(guī)律不一致的問題，再一次凸顯了引物序列標(biāo)準(zhǔn)化的重要性。此外，該研究也用人體尸檢腦和肝組織做了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)28S rRNA不同亞基的時(shí)序性變化規(guī)律依然存在，是理想的PMI推斷指標(biāo)，豐富了運(yùn)用管家ncRNA進(jìn)行PMI推斷的相關(guān)研究。

常見用于PMI推斷的rRNA主要為28S rRNA和18S rRNA，相較于mRNA，根據(jù)rRNA核糖核蛋白復(fù)合體或不同亞基的時(shí)序性變化規(guī)律進(jìn)行PMI推斷也具有其優(yōu)勢，但還需進(jìn)一步深入研究。除28S rRNA和18S rRNA外，5S rRNA[70-72]、U6 snRNA[73-75]、RNU6B[72]、snoRNA202[76]和SNORD95[77]等其他ncRNA也常被作為PMI研究的候選內(nèi)參指標(biāo)。

2.2 運(yùn)用調(diào)控ncRNA進(jìn)行PMI推斷的相關(guān)研究

隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)的快速發(fā)展及相關(guān)研究技術(shù)的進(jìn)步，包括miRNA、lncRNA和circRNA等在內(nèi)的多種調(diào)控ncRNA的生物學(xué)特性和功能被揭示，逐漸成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。miRNA是一類只有18～24個(gè)核苷酸組成的非編碼小RNA，表達(dá)具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性[78-79]，廣泛參與生物體內(nèi)的各種生理病理過程[80]，是法醫(yī)學(xué)理想的分子標(biāo)志物。自2009年HANSON等[81]首次將miRNA引入法醫(yī)學(xué)研究以來，其應(yīng)用逐漸拓展到體液（斑）鑒定（來源和形成時(shí)間）[82]、個(gè)體年齡推斷[83-84]、死亡原因分析[82，85]和 PMI推斷等領(lǐng)域。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的ncRNA，在多種層面上參與蛋白編碼基因調(diào)控[86]，具有重要的生物學(xué)功能，并且在細(xì)胞能耗上存在優(yōu)勢。部分lncRNA在死亡早期的改變較mRNA可能更為迅速、靈敏，有望作為早期PMI推斷指標(biāo)。circRNA是2013年以來被重新認(rèn)識(shí)的一類ncRNA[87-90]，其分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能夠耐受核糖核酸酶和核酸外切酶的降解，有更好的穩(wěn)定性，有望成為中晚期PMI推斷的指標(biāo)或理想的內(nèi)參指標(biāo)。

隨著對(duì)調(diào)控ncRNA認(rèn)識(shí)的深入，法醫(yī)學(xué)者們也開始檢測各ncRNA在死后組織內(nèi)的時(shí)序性變化規(guī)律用于PMI推斷。其中，單純運(yùn)用某一類RNA進(jìn)行PMI推斷的研究較少，多為聯(lián)合miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA和其他種類RNA開展多指標(biāo)分析。近10年的相關(guān)研究詳見附表2。

2010年，李文燦等[63]發(fā)現(xiàn)大鼠心肌組織中miR-1在死后120 h內(nèi)含量無明顯變化，之后才開始下降。2012年，張萍等[73]用geNorm軟件[91]分析了死亡早期人體心肌組織中多個(gè)RNA指標(biāo)的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)miR-1的穩(wěn)定性不如U6 snRNA和18S rRNA，但高于管家基因mRNA，提示了內(nèi)參選擇的重要性。2013年，WANG等[74]以U6 snRNA為內(nèi)參，檢測了小鼠肝組織中miR-122、miR-133a、miR-150、miR-195和miR-206在48h內(nèi)的含量變化，發(fā)現(xiàn)上述指標(biāo)在死后24 h內(nèi)保持穩(wěn)定，但miR-133a和miR-206在24h后含量明顯下降。

2013年，ODRIOZOLA等[92]嘗試使用生物鐘節(jié)律基因相關(guān)miRNA推斷PMI，檢測了在人體玻璃體液中表達(dá)豐度較高的7個(gè)miRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)各miRNA的含量與PMI無關(guān)，但miR-541和miR-142-5p的表達(dá)與晝夜節(jié)律有關(guān)。然而，LECH等[93]在血跡形成時(shí)間的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-541在血液中的表達(dá)豐度太低，而miR-142-5p的表達(dá)與晝夜節(jié)律無關(guān)。2015年，CORRADINI等[77]對(duì)上述研究進(jìn)行了完善，檢測了U6 snRNA、SNORD95、SNORD61和10個(gè)miRNA在血液和玻璃體液中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)SNORD95在兩種體液中均表達(dá)穩(wěn)定，適合作為內(nèi)參指標(biāo)。該研究也證實(shí)，玻璃體液中miR-106b和miR-96、血液中miR-142-5p和miR-219的含量變化與晝夜節(jié)律有關(guān)，可用于PMI推斷，但不足之處是樣本量較小。同年，SHARMA等[94]檢測了小鼠心腦組織中拮抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子（apoptosis antagonizing transcription factor，AATF）的RNA組（miR-2909和靶基因AATF mRNA）的死后變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)AATF mRNA與晝夜節(jié)律的相關(guān)性高于miR-2909，且兩者之間存在協(xié)同變化關(guān)系，此研究也為PMI推斷提供了一種新思路。

上述以miRNA為核心指標(biāo)的研究在PMI推斷領(lǐng)域取得了明顯進(jìn)展，但也存在一些不足，如環(huán)境溫度設(shè)定單一、內(nèi)參指標(biāo)選擇單一、缺乏組織多樣性、數(shù)學(xué)模型簡化及缺乏驗(yàn)證等。針對(duì)上述問題，筆者所在的課題 組 于 2014 年以來進(jìn) 行 了 系列研究[47-48，71，75，95-100]，主要結(jié)果有：（1）挑選一批特異性強(qiáng)、死后變化敏感的RNA指標(biāo)［β-actin、CDC25B和神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白2（nerve injury-induced protein 2，NINJ2）等］，在不同PMI的大鼠和人體多種組織樣本中進(jìn)行批量驗(yàn)證，明確其時(shí)序性變化規(guī)律（死后24 h內(nèi)或0～144 h），作為PMI推斷的指標(biāo)；（2）將組織特異性miRNA和5S rRNA等小分子RNA納入研究，拓展候選內(nèi)參指標(biāo)的選擇范圍，通過聯(lián)用多種篩選軟件，挑選出一些保守性強(qiáng)的小分子RNA作為內(nèi)參指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，如多組織通用的5S rRNA，腦組織miR-125b、肝組織miR-122和脾組織miR-143等；（3）創(chuàng)新性應(yīng)用R軟件等數(shù)學(xué)工具在不同組織中建立以RNA表達(dá)量、溫度和PMI為參數(shù)的多元數(shù)學(xué)模型，有效解決溫度因素的影響，并可將人體樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代驗(yàn)證，使模型具有成長性。但是在上述研究中也發(fā)現(xiàn)了新問題，相較于中晚期PMI（48～144 h），上述模型在48 h內(nèi)的推斷誤差較大，分析原因是指標(biāo)的篩選力度不足，較為依賴文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究，仍然缺少在死亡早期即發(fā)生特異性改變的RNA指標(biāo)。為此，TAO等[47]和WANG等[48]也嘗試使用高通量表達(dá)譜芯片旨在篩選一批在死亡早期即敏感變化的RNA指標(biāo)，以期完善上述系列研究，提高早期PMI推斷的準(zhǔn)確性。

運(yùn)用lncRNA和circRNA進(jìn)行PMI推斷的相關(guān)研究較少，在過去幾年偶有報(bào)道。2015年，KRAUS等[101]檢測了人不同部位腦組織中90多個(gè)lncRNA的表達(dá)情況，并篩選出5個(gè)在死后14～27 h含量穩(wěn)定的lncRNA，分別為 LUST、IGF2AS、7SK、HOXA6as和NDM29，可作為PMI推斷的內(nèi)參指標(biāo)。2018年起，TU等[102-103]以小鼠腦、心肌和肝組織為研究樣本，將GAPDH、RPS18、β-actin mRNA和U6 snRNA作為推斷指標(biāo)，將miR-122、miR-133a、LC-Ogdh（同時(shí)檢測環(huán)形和線形產(chǎn)物）和circ-AFF1作為內(nèi)參指標(biāo)，建立了死后8 d內(nèi)的多指標(biāo)數(shù)學(xué)模型推斷PMI，聯(lián)合3種組織進(jìn)行驗(yàn)證，推斷誤差在0.5d左右。2019年，郝爾娃等[104]檢測了小鼠腦組織中CDR1as、Rims2和Dym circRNA的時(shí)序性變化規(guī)律，結(jié)果表明，CDR1as較為穩(wěn)定，適合作為內(nèi)參指標(biāo)，而Rims2和Dym的含量隨PMI延長而降低。該研究的不足之處是時(shí)間節(jié)點(diǎn)設(shè)置較少，circRNA指標(biāo)的死后變化規(guī)律亟待明確。

在PMI推斷領(lǐng)域，lncRNA和circRNA的研究尚處于起步階段，而研究較為成熟的miRNA也經(jīng)常作為內(nèi)參指標(biāo)[92，95-99，105]，目前尚缺乏對(duì)各調(diào)控 ncRNA 整體表達(dá)變化規(guī)律的研究。與mRNA和其他管家ncRNA相比，調(diào)控ncRNA在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，在死亡早期的變化較其他類型的RNA更為敏感、迅速，可作為較早期PMI推斷的候選指標(biāo)。此外，miRNA在死亡原因分析中的應(yīng)用在近幾年也有報(bào)道，有望用于不同死亡原因下的PMI推斷研究，但都需批量篩選和鑒定。另外，在轉(zhuǎn)錄組學(xué)快速發(fā)展的前提下，下一步的研究可以通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序或RNA芯片技術(shù)，一次性獲得死后組織樣本中各RNA的表達(dá)信息，并通過標(biāo)準(zhǔn)化的生物信息分析流程（差異表達(dá)分析、聚類分析和功能富集分析等），明確機(jī)體死后一段時(shí)間內(nèi)mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA等的表達(dá)譜改變，科學(xué)有效地篩選一批候選推斷指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，還可通過建立內(nèi)源競爭性RNA網(wǎng)絡(luò)，尋找具有對(duì)應(yīng)關(guān)系的分子（指標(biāo)）對(duì)或分子（指標(biāo)）群，如lncRNA-miRNA-mRNA、circRNA-miRNA-mRNA等，闡明死后特異性變化RNA指標(biāo)的具體調(diào)控機(jī)制，為PMI的準(zhǔn)確推斷提供研究基礎(chǔ)，使之較少受到各種內(nèi)外因素的影響。

3 現(xiàn)有問題及展望

雖然國內(nèi)外學(xué)者已做了許多相關(guān)研究，但在運(yùn)用RNA死后降解變化規(guī)律推斷PMI的實(shí)踐探索中，還存在著如下問題：（1）雖然研究人員均采用一種或多種實(shí)質(zhì)器官或體液組織開展研究，但多數(shù)研究缺乏對(duì)各組織中RNA表達(dá)豐度的考量，應(yīng)先篩選表達(dá)譜廣、表達(dá)豐度較高的指標(biāo)用于下一步分析。（2）由于人體死亡后不同個(gè)體間存在著諸如溫度、濕度、營養(yǎng)或疾病狀態(tài)、死亡原因等內(nèi)外因素的干擾，無法進(jìn)行系統(tǒng)規(guī)律的研究，通過動(dòng)物模型研究機(jī)體死亡后RNA的變化規(guī)律對(duì)人體PMI推斷有著重要的參考價(jià)值，但是目前動(dòng)物模型的設(shè)置存在死因單一、環(huán)境溫度或濕度設(shè)定單一以及缺乏人體樣本驗(yàn)證的問題，需要進(jìn)一步完善。（3）qRT-PCR作為快速高效的RNA定量技術(shù)，在PMI推斷相關(guān)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，但由于該方法得到的結(jié)果依賴內(nèi)參指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化，因此內(nèi)參指標(biāo)的篩選和驗(yàn)證應(yīng)該得到足夠重視，筆者建議使用內(nèi)參篩選工具 geNorm[91]、NormFinder[106]、BestKeeper[107]、RefFinder[107]等，并篩選出兩個(gè)及以上的內(nèi)參指標(biāo)，繼而分析內(nèi)參指標(biāo)和各影響因素的關(guān)系；此外，qRTPCR實(shí)驗(yàn)流程應(yīng)嚴(yán)格按照MIQE指南進(jìn)行，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。（4）現(xiàn)有推斷指標(biāo)還是以管家基因mRNA為主，而內(nèi)參指標(biāo)以小分子ncRNA為主，但兩者的研究方式并不完全一致，研究者在聯(lián)合使用時(shí)應(yīng)引起重視。（5）用于PMI推斷的RNA指標(biāo)篩選力度依然不足，尋找在死亡早期即敏感變化的RNA指標(biāo)，或?qū)ふ以谒篮笠欢螘r(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定、之后持續(xù)變化的RNA指標(biāo)依然是今后研究的重點(diǎn)，借助高通量測序或芯片進(jìn)行批量篩選或是可行的方式。（6）目前研究缺乏RNA指標(biāo)的功能性分析，在未來的研究中可適當(dāng)篩選并驗(yàn)證細(xì)胞死亡相關(guān)的指標(biāo)，并通過細(xì)胞或分子實(shí)驗(yàn)闡明其死后的表達(dá)變化機(jī)制，為運(yùn)用RNA推斷PMI提供理論基礎(chǔ)。（7）多方法、多組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組學(xué)及其相關(guān)的基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和微生物組學(xué)等）聯(lián)用較少，機(jī)體死后各種時(shí)序性變化是一個(gè)有機(jī)整體，多方法或者多組學(xué)聯(lián)用有望綜合發(fā)揮作用，提升PMI推斷的精確性。（8）多數(shù)研究的數(shù)學(xué)工具較為簡單，建立的PMI推斷模型缺乏成長性，而日益興起的人工智能算法有望為PMI推斷提供足夠的技術(shù)支撐。

本文以文獻(xiàn)報(bào)道時(shí)間（2010年以前/以后）和RNA類型（管家/調(diào)控）為主線，分別綜述了運(yùn)用mRNA和ncRNA進(jìn)行PMI推斷的系列研究。相較于其他推斷方法，運(yùn)用RNA特異性變化規(guī)律推斷PMI具有一定優(yōu)勢（如組織特異性、種類豐富、表達(dá)迅速、相對(duì)穩(wěn)定、具有日夜節(jié)律等），但也存在一些局限（費(fèi)用昂貴、實(shí)驗(yàn)條件要求高、流程相對(duì)繁瑣等）。因此，現(xiàn)有多數(shù)研究仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，但也有學(xué)者嘗試提出標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)流程，并以創(chuàng)建試劑盒的方式使之應(yīng)用于實(shí)踐，然而還需進(jìn)一步探索。另外，單純運(yùn)用mRNA或者某種ncRNA開展研究也具有一定的局限性，尋找具有對(duì)應(yīng)關(guān)系的指標(biāo)對(duì)或群具有其應(yīng)用前景。制約PMI推斷精確性的重要因素包括環(huán)境因素和個(gè)體差異，因此，方法技術(shù)的革新（一步法qRT-PCR、數(shù)字PCR、多內(nèi)參指標(biāo)、機(jī)器學(xué)習(xí)方法、具有成長性的數(shù)學(xué)模型）和批量人體樣本的驗(yàn)證都至關(guān)重要。此外，通過細(xì)胞或分子實(shí)驗(yàn)尋找具有對(duì)應(yīng)關(guān)系的指標(biāo)對(duì)或群，也是未來研究的趨勢，在轉(zhuǎn)錄組學(xué)的基礎(chǔ)上結(jié)合多組學(xué)分析，有望能夠提升PMI推斷的精確性。