外周血Foxp3、RANTES聯(lián)合檢測(cè)對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的臨床診斷價(jià)值

陳艷青，張娟，呂霞明

(張家口市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,張家口 075000)

自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15%～25%,連續(xù)發(fā)生3次及以上自然流產(chǎn)即為復(fù)發(fā)性流產(chǎn),也稱(chēng)習(xí)慣性流產(chǎn)[1]。導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因多種多樣,例如,夫婦或胚胎染色體異常、孕婦內(nèi)分泌異常及子宮解剖結(jié)構(gòu)異常等[2]。但是約有50%的孕婦復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因不明確,臨床上稱(chēng)為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn),主流觀點(diǎn)認(rèn)為可能與母體免疫平衡失調(diào)和免疫耐受異常有關(guān)[3-4]。相關(guān)研究顯示,叉頭框蛋白p3(forkhead box protein p3,Foxp3)是與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在維持機(jī)體免疫耐受中發(fā)揮著重要作用[5-6]。T細(xì)胞正常表達(dá)和分泌刺激因子(regulation on activation normal T-cell expressed and secreted,RANTES)能夠特異性趨化T細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞,參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[7]。目前已有研究表明,Foxp3及RANTES與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān),然而Foxp3與RANTES對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷價(jià)值尚未報(bào)道[8-9]。因此,本研究通過(guò)檢測(cè)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦和正常妊娠孕婦血清Foxp3和RANTES表達(dá)水平,分析Foxp3和RANTES對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷價(jià)值,為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的臨床診療提供一定幫助。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2021年7月至2022年9月本院收治的128例原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治的專(zhuān)家共識(shí)》中原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10];(2)B超顯示胚胎停止發(fā)育;(3)連續(xù)發(fā)生3次及以上自然流產(chǎn);(4)年齡20～40歲;(5)患者及其配偶染色體正常;(6)內(nèi)分泌正常。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)生殖器官解剖畸形;(2)孕婦存在吸毒、吸煙、酗酒等不良嗜好;(3)妊娠期間發(fā)生病毒感染;(4)伴有免疫功能缺陷;(5)妊娠期間精神狀態(tài)嚴(yán)重異常;(6)重要臟器發(fā)生嚴(yán)重性疾病。

另選取同期于本院體檢的128例健康妊娠者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)生育過(guò)健康足月胎兒;(2)無(wú)自然流產(chǎn)史、死產(chǎn)史。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)內(nèi)分泌疾病、免疫系統(tǒng)缺陷、病毒感染;(2)重要臟器功能異常;(3)無(wú)上述不良嗜好;(4)距上次分娩<1年。

本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.外周血Foxp3和RANTES水平檢測(cè):抽取兩組受檢者空腹靜脈血5 ml,取適量血液樣品離心,保留上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)Foxp3和RANTES水平。Foxp3 ELISA試劑盒(貨號(hào):F00843)購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司;RANTES ELISA試劑盒(貨號(hào):A096884)購(gòu)自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司。arioskan LUX多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

2.免疫指標(biāo)檢測(cè):取適量血液樣品,抗凝處理后離心,分離外周單細(xì)胞并置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入胎牛血清、離子霉素、莫能菌素、佛波酯混勻,室溫孵育4 h。加入FITC標(biāo)記的抗人CD4抗體和抗人CD25各10 μl,混勻后避光室溫孵育20 min,加入100 μl細(xì)胞固定液后再次孵育20 min。離心棄上清,加入破膜液100 μl,并加入抗人白細(xì)胞介素(IL)-17A和抗人Foxp3各10 μl。采用Attune CytPix成像型流式細(xì)胞儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)檢測(cè)輔助性T細(xì)胞(Th17)和Treg百分比,并計(jì)算Th17/Treg。

3.資料收集:收集兩組孕婦年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、孕周、孕次等基本資料。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、病例組和對(duì)照組一般資料比較

病例組和對(duì)照組間年齡、BMI、孕周比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而孕次比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=9.000,P<0.05)(表1)。

表1 病例組和對(duì)照組一般資料比較[(-±s),n(%)]

二、病例組和對(duì)照組外周血Foxp3和RANTES水平比較

經(jīng)檢驗(yàn),與對(duì)照組比較,病例組外周血Foxp3[(98.55±13.67)ng/ml vs.(131.36±19.71)ng/ml]和RANTES[(179.28±25.72)ng/ml vs.(232.13±31.04)ng/ml]水平顯著降低(t=15.475、14.833,P<0.05)。

三、病例組和對(duì)照組免疫指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較,病例組Th17比例和Th17/Treg顯著升高(t=14.495、26.468,P<0.05),Treg比例顯著降低(t=13.776,P<0.05)(圖1、表2)。

圖1 病例組和對(duì)照組Th17和Treg流式細(xì)胞圖

表2 病例組和對(duì)照組免疫指標(biāo)比較(-±s)

四、外周血Foxp3和RANTES水平與免疫指標(biāo)和原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血Foxp3水平與Th17、Th17/Treg呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.523、-0.476,P<0.05),與Treg呈顯著正相關(guān)(r=0.517,P<0.05);RANTES水平也與Th17、Th17/Treg呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.469、-0.544,P<0.05),與Treg呈顯著正相關(guān)(r=0.602,P<0.05)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,外周血Foxp3和RANTES水平與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.539、-0.554,P<0.05)。

五、外周血Foxp3和RANTES水平對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷價(jià)值

以Foxp3和RANTES水平為檢驗(yàn)變量,以原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生為因變量繪制ROC曲線(xiàn),結(jié)果顯示,血清Foxp3水平單獨(dú)診斷原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的AUC為0.820[95%CI(0.767,0.865)],其敏感度、特異度分別為70.31%、85.94%,最佳截?cái)嘀禐?19.68 ng/ml;血清RANTES水平單獨(dú)診斷原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的AUC為0.840[95%CI(0.789,0.883)],其敏感度、特異度分別為69.53%、85.16%,最佳截?cái)嘀禐?98.84 ng/ml;血清Foxp3和RANTES聯(lián)合診斷原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的AUC為0.909[95%CI(0.867,0.942)],其敏感度、特異度分別為86.72%、82.81%,兩者聯(lián)合診斷的AUC顯著大于Foxp3單獨(dú)診斷的AUC(Z=4.165,P=0.000)和RANTES單獨(dú)診斷的AUC(Z=3.183,P=0.002)(圖2、表3)。

圖2 外周血Foxp3和RANTES水平診斷原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的ROC曲線(xiàn)

表3 外周血Foxp3和RANTES水平對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷價(jià)值

討 論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)會(huì)使子宮內(nèi)膜變薄、導(dǎo)致宮腔粘連,也易出現(xiàn)盆腔感染和盆腔炎,嚴(yán)重則導(dǎo)致不孕,除了對(duì)患者身體造成一定損傷外,也會(huì)對(duì)患者心理上帶來(lái)傷害,出現(xiàn)焦慮、抑郁等消極情緒,影響工作和生活[11-12]。及時(shí)診斷對(duì)患者維持正常妊娠也具有重要意義,因此,外周血Foxp3聯(lián)合RANTES對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷價(jià)值值得探討。

Foxp3主要表達(dá)于人類(lèi)胸腺、淋巴結(jié)、脾臟等淋巴器官及組織中,人Foxp3基因定位于染色體Xp11.23,影響免疫失衡相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展[13-14]。曹智等[15]研究表明,Foxp3在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中的陽(yáng)性率高于正常組織,有望成為該疾病治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,與正常妊娠孕婦外周血Foxp3水平比較,原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦外周血Foxp3水平顯著降低,與趙廣彩等[8]的研究結(jié)果一致。本研究進(jìn)行的Spearman相關(guān)性分析也顯示,外周血Foxp3水平與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生存在一定相關(guān)性,提示Foxp3與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步分析外周血Foxp3水平對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷價(jià)值發(fā)現(xiàn),外周血Foxp3水平診斷原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的AUC達(dá)0.820,特異度和敏感較高,表明其診斷價(jià)值較高。

RANTES是趨化性細(xì)胞因子CC亞族成員,又稱(chēng)CCL5,人RANTES基因位于染色體17q11.2-q12區(qū)域,是維持正常妊娠的重要基因[16]。張騰飛等[17]的研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜異位癥患者經(jīng)治療后,血清RANTES水平降低,癥狀得到改善。本研究中原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦外周血RANTES水平顯著低于正常妊娠孕婦,且外周血RANTES水平與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生存在顯著相關(guān)性,提示原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生可能與RANTES異常表達(dá)有所關(guān)聯(lián)。陳慧等[9]的研究中,不僅發(fā)現(xiàn)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與RANTES有關(guān),還發(fā)現(xiàn)RANTES與患者流產(chǎn)次數(shù)有關(guān)。本研究ROC分析表明,外周血RANTES對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)具有一定診斷價(jià)值,且Foxp3和RANTES聯(lián)合診斷的AUC和敏感度高于二者單獨(dú)診斷,提示二者聯(lián)合對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷價(jià)值更高,有望成為早期診斷及判斷療效的指標(biāo)。

Th17和Treg是不同的T細(xì)胞亞群,Th17能夠分泌IL-17等促炎因子,從而介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng),而Treg是維持機(jī)體免疫耐受的關(guān)鍵因子,能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力;Th17數(shù)量增加、Treg數(shù)量減少不利于母體免疫耐受的維持,導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[18]。本研究發(fā)現(xiàn),相比于正常妊娠對(duì)照組,病例組Th17比例和Th17/Treg顯著升高,而Treg顯著降低,提示原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦Th17比例和Treg細(xì)胞失衡,導(dǎo)致母體免疫系統(tǒng)排斥胚胎,影響胚胎發(fā)育,最終造成流產(chǎn)。徐彩等[19]進(jìn)行的動(dòng)物試驗(yàn)表明,自擬固胎煎對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠的治療作用可能與改善免疫平衡及蛻膜環(huán)境有關(guān)。本研究進(jìn)一步采用Pearson分析法分析原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦外周血Foxp3和Th17、Treg、Th17/Treg的關(guān)系,結(jié)果表明,外周血Foxp3、RANTES水平均與Th17、Th17/Treg呈顯著負(fù)相關(guān),與Treg均呈顯著正相關(guān)。結(jié)合前人研究結(jié)果推測(cè)Foxp3、RANTES均與機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡密切相關(guān),Foxp3通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)影響Treg的活性,RANTES與相應(yīng)受體結(jié)合后,對(duì)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用,但其中具體作用機(jī)制尚不清楚,有待后續(xù)深入研究[20-21]。

綜上所述,Foxp3和RANTES水平均與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦的免疫平衡失調(diào)有關(guān),且二者聯(lián)合對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷價(jià)值較高。但由于本研究例數(shù)較少,Foxp3和RANTES對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷價(jià)值仍需進(jìn)一步驗(yàn)證;此外,Th17與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切,本研究尚未對(duì)兩組研究對(duì)象的炎癥因子水平進(jìn)行比較,有待完善。