冷藏過(guò)程中蝦夷扇貝橫紋肌微觀結(jié)構(gòu)變化與肌原纖維蛋白穩(wěn)定性

姜明慧，田元勇,2,*，閆麗新，王選飛，袁春紅，劉俊榮,2

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；3.日本巖手大學(xué)農(nóng)學(xué)部食料生產(chǎn)環(huán)境學(xué)科，日本 盛岡 0208550）

蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類之一。我國(guó)蝦夷扇貝年產(chǎn)量高達(dá)30萬(wàn) t，零售價(jià)40～50 元/kg，產(chǎn)值達(dá)數(shù)百億元[1]，但活貝流通過(guò)程中運(yùn)輸成本高、風(fēng)味下降嚴(yán)重等問(wèn)題嚴(yán)重制約行業(yè)的發(fā)展[2]。我國(guó)雖然貝類產(chǎn)量居世界首位，但高端刺身級(jí)產(chǎn)品卻鮮有銷售，這除了與消費(fèi)習(xí)慣有關(guān)之外，與基礎(chǔ)理論研究存在局限也有很大關(guān)聯(lián)。在盛行食用刺身的日本，扇貝以閉殼肌生鮮品銷售方式占主要地位，研究人員圍繞著貯藏溫度[3]、氧氣濃度[4]、清洗方法[5]以及季節(jié)[6]等因素對(duì)閉殼肌品質(zhì)的影響進(jìn)行了大量研究。蝦夷扇貝閉殼肌包括橫紋肌和平滑肌兩部分，其中橫紋肌所占比重大，其冰藏過(guò)程中的突出問(wèn)題是由于肌肉收縮引起的質(zhì)地變硬、汁液流失、口感變差。橫紋肌的收縮舒張是以ATP為能量物質(zhì)，在Ca2+及Mg2+參與下肌絲滑動(dòng)的橫橋循環(huán)過(guò)程[7]。貯藏過(guò)程中由于ATP合成終止導(dǎo)致橫橋循環(huán)中斷，進(jìn)而引發(fā)了肌肉僵直。Ca2+在橫紋肌的收縮過(guò)程中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，貯藏過(guò)程中由于肌質(zhì)網(wǎng)對(duì)Ca2+調(diào)節(jié)能力降低也加速了ATP的降解[8]。平滑肌雖然占比較小，但對(duì)活貝長(zhǎng)時(shí)間維持夾持狀態(tài)發(fā)揮著重要的作用，其收縮機(jī)制[9]、鹽溶解性等[10]與橫紋肌存在較大差異。此外，扇貝粗絲由副肌球蛋白和肌球蛋白共同構(gòu)成，可結(jié)合7分子肌球蛋白，與可結(jié)合3分子肌球蛋白的脊椎魚(yú)類以及可結(jié)合4分子肌球蛋白的甲殼類蟹存在顯著差異[11]。這種蛋白結(jié)構(gòu)的差異可能對(duì)不同水產(chǎn)品的貯藏特性產(chǎn)生影響。目前，扇貝橫紋肌收縮機(jī)制的相關(guān)研究較多，但是關(guān)于肌肉收縮引發(fā)的肌肉微觀結(jié)構(gòu)和蛋白理化性質(zhì)的變化缺少深入研究。本研究為解決蝦夷扇貝橫紋肌貯藏過(guò)程中由于肌肉收縮引發(fā)的“硬化”問(wèn)題，將蝦夷扇貝橫紋肌進(jìn)行冷藏，對(duì)僵直前、中、后不同階段的品質(zhì)變化進(jìn)行了分析。通過(guò)透射電子顯微鏡觀察橫紋肌的組織結(jié)構(gòu)變化，測(cè)定ATP含量、肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase及Mg2+-ATPase活力，分析蛋白鹽溶解性的變化規(guī)律，并針對(duì)ATP含量對(duì)蛋白鹽溶解性的影響進(jìn)行了深入探討。通過(guò)以上研究以期明確橫紋肌冷藏過(guò)程中肌原纖維蛋白理化性質(zhì)的變化規(guī)律，為最終解決貯藏過(guò)程中的“硬化”問(wèn)題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）由大連獐子島股份有限公司提供，質(zhì)量（143.41±16.58）g、殼長(zhǎng)度（11.17±0.27）cm。

乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA）、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA）、乙酸、氯化鈉、氫氧化鉀 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；腺嘌呤核苷三磷酸、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑、β-巰基乙醇、無(wú)水甲醇 美國(guó)Sigma公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鹽酸、硫酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、高氯酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碘化鉀 上海麥克林生化科技有限公司；馬來(lái)酸、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)R-250 北京索萊寶科技有限公司；鉬酸銨、米吐?tīng)?上海阿拉丁生化科技股份有限公司。氫氧化鉀、無(wú)水甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；AE-6500垂直電泳槽 日本ATTO公司；OS-I型回旋脫色搖床 大連競(jìng)邁公司；JEM-1200EX透射電子顯微鏡 日本電子公司；UV-1800PC紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Synergy H1酶標(biāo)儀 美國(guó)柏騰公司；HG-200高速分散均質(zhì)機(jī) 日本HSIANGTAI；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)HERMLE Labortechnik GmbH公司；BS224S型精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PB-10 pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；Milli-Q超純水凈化儀 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

活品底播蝦夷扇貝送達(dá)至實(shí)驗(yàn)室后，立即放入充氧循環(huán)海水中緩沖處理12 h，待其生理狀態(tài)穩(wěn)定后快速開(kāi)殼取橫紋肌。置于預(yù)冷的塑料盒內(nèi)，覆保鮮膜密封后4 ℃低溫貯藏，分別于第0、5天觀察外觀和微觀形態(tài)，在第0、2、5天時(shí)取樣進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 橫紋肌的微觀結(jié)構(gòu)觀察

取扇貝橫紋肌，從中心位置切取1 mm×1 mm×3 mm的長(zhǎng)方體，放入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中固定2 h后，用4 ℃ 0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗3 次，每次10～15 min。再用0.1 g/L四氧化鋨室溫下固定1～2 h，用0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗3 次。之后分別用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%乙醇溶液逐級(jí)脫水，再用無(wú)水乙醇脫水1 次，環(huán)氧丙烷置換2 次，每次10 min。脫水后用溶劑I（V（環(huán)氧丙烷）∶V（包埋劑）＝1∶1）滲透1～2 h，再用溶劑II（V（環(huán)氧丙烷）∶V（包埋劑）＝1∶2）滲透過(guò)夜，最后用純包埋劑滲透4～5 h。將處理好的組織塊包埋在包埋模板中用烤箱烘干，分別于37、45、60 ℃下烘烤12、12、24 h，聚合硬化后形成包埋塊。用玻璃刀將包埋塊切成薄片后，用0.2 g/L醋酸雙氧鈾避光染色30 min，再用檸檬酸鉛染色10～20 min。超薄切片制作完成后利用JEM-1200EX透射電子顯微鏡對(duì)肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.3.3 SDS-PAGE分析

將蝦夷扇貝橫紋肌肌肉切碎，加入10 倍體積緩沖液（含0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）攪勻，10 000 r/min、30 s均質(zhì)3 次，即得到橫紋肌全蛋白勻漿液。使用電泳上樣液（含0.14 mol/L SDS、2 mol/L尿素、0.43 mol/Lβ-巰基乙醇、0.1 g/L溴酚藍(lán)、50 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8）將蛋白質(zhì)量濃度稀釋至1～2 mg/mL，混勻后100 ℃條件下加熱5 min，即得到電泳樣品，進(jìn)樣量為15 μL。采用垂直板進(jìn)行PAGE，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠和7.5%分離膠配制膠板。采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色、脫色液（V（甲醇）∶V（乙酸）∶V（去離子水）＝3∶1∶6）進(jìn)行脫色，掃描膠片后得到電泳圖譜。

1.3.4 橫紋肌ATP及其關(guān)聯(lián)物含量測(cè)定

ATP及其關(guān)聯(lián)物（ADP、AMP、IMP、HxR、Hx）提取方法參照Hu Yaqin等[12]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取1.0 g橫紋肌，加入10 mL預(yù)冷的0.8 mol/L高氯酸，冰浴下?lián)v碎10 min，用2.0 mol/L KOH溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0～3.5后用超純水定容至20 mL。5 000×g條件下離心5 min，取4.0 mL上清液過(guò)膜后加入1.0 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），搖勻，采用反向高效液相色譜測(cè)定ATP及其關(guān)聯(lián)化合物含量。高效液相色譜分析條件：SinoChrom ODS-BP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；二極管陣列檢測(cè)器；流動(dòng)相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5），固定相：甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.7 mL/min；進(jìn)樣量：0.02 mL；分流比：8∶2。利用K值表征水產(chǎn)品的新鮮程度，按式（1）計(jì)算。

式中：ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx分別表示該物質(zhì)的含量/（μmol/g）。

1.3.5 橫紋肌肌原纖維蛋白提取及Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活力測(cè)定

肌原纖維蛋白提取參照吳忠等[13]的方法并稍作修改。將蝦夷扇貝橫紋肌切碎，加入10 倍體積pH 7.5的緩沖液（含0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，下同）攪勻，5 000×g離心5 min去上清液，重復(fù)漂洗3 次。加入10 倍體積緩沖液，10 000 r/min、30 s均質(zhì)3 次，5 000×g離心5 min去上清液，重復(fù)漂洗3 次。加入適量緩沖液懸濁，過(guò)雙層紗布即得到肌原纖維蛋白，全程操作均在4 ℃下進(jìn)行。利用雙縮脲法[14]測(cè)蛋白質(zhì)量濃度，然后用緩沖溶液將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至1.0 mg/mL用于酶活力測(cè)定。

Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活力測(cè)定參考Ojima等[15]的方法并稍作修改，在玻璃管中加入9.0 mL反應(yīng)液（Ca2+-ATPase：2 mmol/L ATP、5 mmol/L CaCl2、25 mmol/L pH 7.0 Tris-馬來(lái)酸、0.5 mol/L KCl；Mg2+-ATPase：2 mmol/L ATP、5 mmol/L MgCl2、25 mmol/L pH 7.0 Tris-馬來(lái)酸、0.1 mol/L KCl），置于20 ℃水浴鍋內(nèi)，5 min后加入1 mL 1 mg/mL的肌原纖維蛋白懸濁液開(kāi)始反應(yīng)。分別于0、2、5、10、15、20、25、30 min時(shí)取出1.0 mL混合液，加入0.5 mL 2.6 mol/L高氯酸以終止反應(yīng)。靜置沉淀后取0.5 mL上清液加入1.75 mL硫酸鉬酸銨和0.25 mL米吐?tīng)?，混勻?5 ℃水浴發(fā)色45 min，640 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。Ca2+-ATPase及Mg2+-ATPase活力以每毫克蛋白每分鐘分解ATP產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷的物質(zhì)的量表示，具體計(jì)算見(jiàn)公式（2）。

式中：ρ為反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；t為反應(yīng)時(shí)間/min。

1.3.6 橫紋肌蛋白鹽溶解度測(cè)定

將蝦夷扇貝橫紋肌切碎，加入10 倍體積緩沖液（含0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），10 000 r/min、30 s均質(zhì)3 次，得到全蛋白勻漿液。將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至10 mg/mL，通過(guò)添加NaCl和去離子水，將體系中NaCl終濃度分別調(diào)至0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mol/L，蛋白終質(zhì)量濃度調(diào)整至5 mg/mL?；靹蚝箪o置20 min，10 000×g條件下離心10 min，通過(guò)上清液蛋白質(zhì)量濃度和體積計(jì)算溶解度。蛋白鹽溶解度的計(jì)算見(jiàn)公式（3）。

式中：ρ1為全蛋白勻漿液中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V1為全蛋白勻漿液體積/mL；ρ2為離心后上清液中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V2為離心后上清液體積/mL。

1.3.7 橫紋肌蛋白鹽溶解度的測(cè)定及蛋白組分分析

在1.3.6節(jié)中得到的橫紋肌全蛋白勻漿液中添加外源ATP，并通過(guò)添加去離子水和NaCl將體系中ATP終濃度分別調(diào)至0、1、2、5、10、20 mmol/L，NaCl終濃度為0.5 mol/L，蛋白終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，混勻后靜置20 min，10 000×g條件下離心10 min，測(cè)定上清液體積和蛋白質(zhì)量濃度后，按公式（3）計(jì)算蛋白鹽溶解度。

將新鮮的扇貝橫紋肌切碎后分為3 組，分別加入10 倍體積的緩沖液A（含5 mmol/L EDTA、0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）、緩沖液B（含5 mmol/L EGTA、0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）和緩沖液C（含0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），10 000 r/min、30 s均質(zhì)3 次后，分別作為EDTA組、EGTA組及對(duì)照組，對(duì)均質(zhì)后3 組中ATP、ADP、AMP含量和鹽溶解度、上清液蛋白組成進(jìn)行比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，用Excel 2003軟件進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦夷扇貝冷藏期間橫紋肌組織結(jié)構(gòu)的變化

2.1.1 蝦夷扇貝外觀形態(tài)變化

圖1 蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間的形態(tài)變化Fig. 1 Shrinkage of scallop striated adductor muscle during chilling storage

如圖1所示，橫紋肌在貯藏過(guò)程中僵直明顯，質(zhì)地變硬，光澤度及飽滿度變差，體積明顯縮小。貯藏5 d后其厚度減少了20%。通常魚(yú)類死后，貯藏過(guò)程中魚(yú)體在肌肉收縮力和骨骼支撐力的作用下，呈現(xiàn)“僵直-解僵”過(guò)程并出現(xiàn)裂縫。而扇貝橫紋肌離體后無(wú)骨骼支撐，貯藏過(guò)程中肌肉收縮導(dǎo)致宏觀呈現(xiàn)出逐漸“硬化”的狀態(tài)，未觀察到“解僵”過(guò)程和裂縫現(xiàn)象。這種宏觀變化對(duì)肌肉的微觀結(jié)構(gòu)和功能性也產(chǎn)生了較大影響，如攀鱸魚(yú)在貯藏過(guò)程中持水能力會(huì)逐漸下降[16]。同時(shí)，肌肉中水分含量的降低也會(huì)對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[17]。

2.1.2 蝦夷扇貝微觀結(jié)構(gòu)變化

在貯藏開(kāi)始時(shí)，蝦夷扇貝橫紋肌肌纖維的結(jié)構(gòu)完整，Z線清晰，肌節(jié)平均長(zhǎng)度為0.75 μm（圖2A1）；貯藏5 d后肌纖維結(jié)構(gòu)仍相對(duì)完整，但Z線變得模糊，肌束間隙增大，肌節(jié)平均長(zhǎng)度為0.62 μm，比0 d時(shí)明顯縮短約17.33%，此外，肌原纖維之間可觀察到大量空泡（圖2A2）。0 d 時(shí)橫紋肌中線粒體結(jié)構(gòu)完整、數(shù)量多、體積大（圖2B1）；5 d時(shí)線粒體出現(xiàn)明顯空泡樣變，嵴斷裂嚴(yán)重，但雙層膜結(jié)構(gòu)仍完整（圖2B2）。Ayala等[18-19]對(duì)鯛魚(yú)肌肉微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察也發(fā)現(xiàn)，在4 ℃冷藏5 d后，Z線出現(xiàn)輕微的斷裂，線粒體腫脹且內(nèi)部渾濁。以上結(jié)果說(shuō)明冷藏期間橫紋肌的微觀結(jié)構(gòu)仍比較完整，肌纖維結(jié)構(gòu)比較清晰；但肌纖維連接處出現(xiàn)大量空泡、Z線模糊。因此需進(jìn)一步探討蝦夷扇貝冷藏過(guò)程中是否發(fā)生了蛋白質(zhì)的降解。

圖2 橫紋肌冷藏期間微觀結(jié)構(gòu)變化Fig. 2 Changes in microstructure of striated adductor muscle during chilling storage

2.1.3 蝦夷扇貝橫紋肌蛋白組成的變化

圖3 蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間蛋白組成的變化Fig. 3 Changes in protein components in scallop striated adductor muscle during chilling storage

利用SDS-PAGE對(duì)貯藏0、2、5 d的扇貝橫紋肌進(jìn)行全蛋白組分分析，結(jié)果如圖3所示，貯藏期間肌球蛋白、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白等各組分的蛋白含量均未出現(xiàn)明顯變化，未觀察到新條帶的產(chǎn)生。蝦夷扇貝橫紋肌在冰藏條件下，水溶性蛋白的含量在5 d內(nèi)也無(wú)顯著變化[20]。相比之下，鱔魚(yú)肌肉在冷藏5 d內(nèi)，肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白均出現(xiàn)了明顯的降解[21]?？赡苁桥c魚(yú)類肌肉相比，一方面扇貝橫紋肌的蛋白性質(zhì)比較穩(wěn)定；另一方面，本研究在前處理過(guò)程中除去了消化腺，減少了冷藏期間蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解。因此蝦夷扇貝生鮮閉殼肌產(chǎn)品的貯藏優(yōu)勢(shì)較大。

2.2 蝦夷扇貝冷藏期間橫紋肌品質(zhì)變化

2.2.1 ATP及其關(guān)聯(lián)物含量變化

圖4 蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間ATP及其關(guān)聯(lián)物含量變化Fig. 4 Changes in contents of ATP and related compounds in scallop striated adductor muscle during chilling storage

蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間ATP及其關(guān)聯(lián)物含量變化如圖4所示，0 d時(shí)的ATP含量為4.39 μmol/g。2 d時(shí)中ATP含量為1.98 μmol/g，未檢測(cè)到HxR和Hx，K值為0。K值是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品鮮度的常用指標(biāo)，一般認(rèn)為水產(chǎn)品K值小于20%時(shí)為非常新鮮。貯藏5 d時(shí)仍檢測(cè)到ATP含量為1.07 μmol/g，雖然檢測(cè)到了HxR及Hx，但K值僅為11.6%。相比之下，活品扇貝在離水干露3 d時(shí)出現(xiàn)死亡，ATP耗盡[22]；大菱鲆和帶魚(yú)在冷藏5 d時(shí)K值升高至40%左右，處于輕微腐敗初期[23-24]。表明扇貝橫紋肌在冷藏期間新鮮度較好、品質(zhì)下降慢。

2.2.2 肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase及Mg2+-ATPase活力變化

圖5 蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間肌原纖維蛋白的Ca2＋-ATPase及Mg2＋-ATPase活力變化Fig. 5 Changes in Ca2+-ATPase and Mg2+-ATPase activity in scallop striated adductor muscle during chilling storage

肌肉蛋白的功能特性及質(zhì)地特性與肌原纖維蛋白的性質(zhì)密切相關(guān)[25-26]，通過(guò)測(cè)定肌原纖維蛋白中肌球蛋白的Ca2+-ATPase活力可較好地反映肌肉品質(zhì)。0 d時(shí)蝦夷扇貝橫紋肌中提取的肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活力為0.41 μmol/（mg·min），冷藏5 d后其活力為0.50 μmol/（mg·min），Ca2+-ATPase活力取決于肌原纖維蛋白中的肌球蛋白，而不受肌動(dòng)蛋白的影響[26-27]，因此推測(cè)冷藏過(guò)程中肌球蛋白并未發(fā)生變性。此外，肌球蛋白的Mg2+-ATPase活力能夠被肌動(dòng)蛋白激活，常用來(lái)反映肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的相互作用[28]，并且Mg2+-ATPase具有更高的敏感性，在肌原纖維蛋白經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間冷藏[29]或低離子緩沖溶液反復(fù)漂洗后[30]，該活力會(huì)出現(xiàn)異常升高。然而在本研究中，Ca2+-ATPase活力在冷藏期間也出現(xiàn)了反常的升高現(xiàn)象，推測(cè)是蝦夷扇貝橫紋肌冷藏過(guò)程中的肌肉收縮使得肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的結(jié)合更加緊密，肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合作用以及提取的肌原纖維蛋白中殘留的Mg2+，共同激活了Mg2+-ATPase的活性，導(dǎo)致實(shí)際檢測(cè)到的Ca2+-ATPase活力中包含了Mg2+-ATPase的部分，使得Ca2+-ATPase活力最終呈現(xiàn)出升高的現(xiàn)象。因此，進(jìn)一步討論肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的結(jié)合作用是否也對(duì)肌肉蛋白溶解性產(chǎn)生了影響。

2.2.3 橫紋肌冷藏期間蛋白鹽溶解度變化

圖6 蝦夷扇貝橫紋肌冷藏期間蛋白溶解性變化Fig. 6 Changes in salt solubility of protein in scallop striated adductor muscle during chilling storage

蛋白的溶解度與肌球蛋白桿部的性質(zhì)密切相關(guān)，如肌球蛋白桿部的降解、聚合會(huì)導(dǎo)致蛋白的鹽溶解度下降[31-32]。由圖6A可知，貯藏相同的時(shí)間，蝦夷扇貝橫紋肌的蛋白溶解度隨著NaCl濃度的增加均呈線性上升趨勢(shì)，貯藏時(shí)間對(duì)蛋白的鹽溶解度影響不大。通常，隨NaCl濃度的增加，魚(yú)類肌肉蛋白溶解度呈S型上升，在NaCl濃度為0.3 mol/L左右時(shí)其蛋白的溶解度迅速升高，在0.5 mol/L附近幾乎全部溶出，溶解度可達(dá)到80%左右[33]，且肌肉鮮度越高溶解度越高。吳忠[34]研究發(fā)現(xiàn)，蝦夷扇貝橫紋肌的水溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為39%，鹽溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34%。但在本研究中，扇貝在鮮度很高的0 d時(shí)，橫紋肌肌肉蛋白鹽溶解度依然很低，在1.0 mol/L NaCl溶液中的溶解度僅約為60%，并且上文中Ca2+-ATPase活力實(shí)驗(yàn)證明了肌球蛋白并未發(fā)生變性，推測(cè)可能由于ATP的降解促使肌球與肌動(dòng)蛋白緊密結(jié)合形成了肌動(dòng)球蛋白，出現(xiàn)了超沉淀現(xiàn)象，對(duì)肌肉蛋白的鹽溶解性產(chǎn)生了影響。為驗(yàn)證該推測(cè)，在含0.5 mol/L NaCl的扇貝肌肉勻漿液中添加外源ATP，再次評(píng)價(jià)了肌肉蛋白鹽溶解度的變化，結(jié)果如圖6B所示。貯藏不同時(shí)間的橫紋肌的肌肉蛋白在添加超過(guò)1.0 mmol/L的ATP后，蛋白溶解度均達(dá)到了80%以上。表明蝦夷扇貝橫紋肌由于肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的結(jié)合作用導(dǎo)致了鹽溶解性降低。并且在冷藏5 d內(nèi)，肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白在結(jié)合狀態(tài)下通過(guò)添加ATP可重新解離，表明其并未喪失活性。

2.2.4 ATP對(duì)橫紋肌蛋白鹽溶解度的影響

圖7 ATP對(duì)蝦夷扇貝肌肉蛋白鹽溶解性的影響Fig. 7 Effect of ATP on salt solubility of scallop striated adductor muscle proteins

貯藏0 d的扇貝橫紋肌并未出現(xiàn)肌肉收縮現(xiàn)象致使肌球和肌動(dòng)蛋白結(jié)合，但蛋白溶出效果仍然很差。推測(cè)可能是在均質(zhì)過(guò)程中細(xì)胞破碎導(dǎo)致Ca2+流出，激活了Ca2+-ATPase活性，而較高的Ca2+-ATPase活性會(huì)導(dǎo)致ATP迅速分解，進(jìn)而引起肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致蛋白溶解度較差；因此，通過(guò)添加EDTA和EGTA螯合肌肉中的Mg2+、Ca2+等金屬離子來(lái)控制其ATPase活性，進(jìn)一步探究均質(zhì)過(guò)程導(dǎo)致的ATP含量變化對(duì)肌肉蛋白鹽溶解性的影響。如圖7所示，對(duì)照組的均質(zhì)過(guò)程導(dǎo)致肌肉中ATP完全被消耗，而EDTA處理組和EGTA處理組中仍能檢測(cè)到少量的ATP，分別為1.17 μmol/g和0.34 μmol/g。同時(shí)，EGTA添加組中，由于肌肉中依然有ATP和Mg2+殘余，促進(jìn)了肌球和肌動(dòng)蛋白解離，因此，在0.4 mol/L NaCl濃度下，溶解度由對(duì)照組的25%上升到了70%（圖7B），并且和對(duì)照組相比在上清液中可檢測(cè)到大量的肌球蛋白（圖7C、D）。Niki等[35]的研究也證明，在肌原纖維蛋白中同時(shí)添加Mg2+、EGTA和ATP能有效促進(jìn)肌球與肌動(dòng)蛋白的解離。

3 結(jié) 論

蝦夷扇貝橫紋肌在冷藏5 d后處于完全“硬化”的狀態(tài)。此時(shí)，肌肉中線粒體出現(xiàn)空泡樣變，嵴斷裂嚴(yán)重，但肌纖維的微觀結(jié)構(gòu)仍比較完整、肌肉中仍有ATP殘留、K值在5 d 時(shí)僅為11.6%，鮮度較高?！坝不睜顟B(tài)下，ATP的降解促使肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白緊密結(jié)合，激活了肌球蛋白的Mg2+-ATPase，并形成了肌動(dòng)球蛋白超沉淀，導(dǎo)致肌肉蛋白鹽溶解性降低，但是通過(guò)外源添加ATP后蛋白溶解度明顯升高，表明這種結(jié)合作用是可逆的，橫紋肌肌肉蛋白仍具有較好的功能性。探討控制蝦夷扇貝橫紋肌“硬化”的方法，對(duì)于提高產(chǎn)品的品質(zhì)和延長(zhǎng)貨架期非常重要，有必要繼續(xù)深入研究。